Способ получения культуры клеток эпидермиса человека

Способ получения культуры клеток эпидермиса человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЭПИДЕРМИСА ЧЕЛОВЕКА, включающий получение из лоскутов кожи исходной суспензии клеток с последующим культивированием ее на подложке в питательной среде 199 или в среде Игла, содержащей витамины и гидрокрртизон , отличающийся тем, что, с целью ускорения роста культуры путем повышения ее физиологической и пролиферативной активности, исходную суспензию клеток получают из регенерирующих участков кожи или лоскутов кожи, предварительно вьщержанных на раневой ожоговой поверхности в течение 1-2 сут или в среде Игла, содержащей 10-20% змбриональной сыворотки человека, 0,1-0,2ед/мл инсулина и 0,1-0,2 ед/мл соматотропного гормона, и культивируют на подложке из человеческого коллагена в питательной среде, дополнительно содержащей 10-20% плацентарной сыворотки и 1-2% плацентарного экстракта.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН ()9) ((!) А (5!)4 С l2 N 5/00 (!3,, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3659090/28-13

I (22) 03.11.83 (46) 23.11.85. Бюл. Ф 43 (7!) Институт биологической физики

АН СССР (72) Б.К.Гаврилюк, Б.Б.Егоров, М.И.Кузин, Г.P.Èâàíèöêèé, В.К.Сологуб, С.С.Морозов и В.Г.Ивков (53) 578.085.23(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 1097671, кл. С 12 N S/00, 1983. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ

КЛЕТОК ЭПИДЕРМИСА ЧЕЛОВЕКА, включающий получение из лоскутов кожи исходной суспензии клеток с последующим культивированием ее на подложке в питательной среде 199 или в среде.

Игла, содержащей витамины и гидрокортизон, отличающийся тем, что, с целью ускорения роста культуры путем повышения ее физиологической и пролиферативной активности, исходную суспензию клеток получают из регенерирующих участков кожи или лоскутов кожи, предварительно выдержанных на раневой ожоговой поверхности в течение 1-2 сут или в среде

Игла, содержащей 10-20% эмбриональной сыворотки человека, 0,1-0,2ед/мл инсулина и 0,1-0,2 ед/мл соматотропного гормона, и культивируют на подложке из человеческого коллагена в питательной среде, дополнительно содержащей 10-20% плацентарной сыворотки и 1-2% плацентарного экстракта.

1193168

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способам культивирования клеток человека и животных.

Цель изобретения — ускорение роста культуры путем повышения ее физиологической и пролиферативной активности, Пример 1. Для получения исходной суспензии эпидермиальных кле- 10 ток берут лоскут кожи из регенерирующего участка кожного покрова боковой поверхности туловища больного с ожогом. Взятый лоскут кожи промывают

2 раза по 5 мин в 0,02Х-ном стандарт-15 ного раствора Версена и помещают для стерилизации в раствор Хенкса с добавлением 10Х бычьей сыворотки, 10 . ед/мл пенициллина, 10 ед/мл стрептомицина и 250 ед/мл нистатина. 20

Лоскут кожи выдерживают в этом раст" воре при +5 C в течение 12 ч и дважды промывают в 0,02Х-ном стандартном растворе Версена. Затем лоскут кожи измельчают ножницами и пипетирова- 25 нием отделяют клетки эпидермиса от дермы, Клетки эпидермиса собирают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Собранные клетки ресуспендиоуют в постовой питательной среде следующего состава: среда Игла, 20Х плацентарной сыворотки, 1% пла" центарного экстракта, 2 ед/мл витамина А, 1 мкг/мл витамина Е, 1 мкг/мл витамина К, 0,2 мкг/мл витамина В, 35 и 0,4 мкг/мл гидрокартизона. Клетки в концентрации 4 ° 10 кл/мл засевают

5 во флаконы Карреля на подложку из человеческого коллагена. Культивирование проводят в атмосфере 95Х возду-<0 ха и 57. СО при 36 С и 807 влажности, с однократной сменой среды на четвертый день культивирования. На восьмой дель культивирования колонии клеток эпидермиса вырастаютв сплошной газонМ

Выход клеток с 1 см2 подложки составляет 5 10 кл/см .

Пример 2. Исходную суспензию эпидермальных клеток получают из лоскутов кожи, взятого со здорового 50 участка кожи больного, и стимулированного помещением его Hà ожоговую гранулирующую поверхность раны этого больного на двое Суток.

После стимуляции лоскут кожи про- 55 мывают и стерилизуют,, как описано в примере 1 ° Затем помещают для дезагрегации в 0,27-ный раствор коллагеназы, приготовленный на растворе Хенкса, и выдерживают в нем при комнатной температуре в течение 6 ч. Отделение эпидермиса от дермы и последуют щую его дезагрегацию пипетированием контролируют под бинокулярным микроскопом. Клетки эпидермиса собирают центрифугированием, как описано в примере 1. Собранные клетки ресуспендируют в питательной среде следующего состава: среда 19о, 157 плацентарной сыворотки; 2Х плацентарного экстракта; витамины: А 4 ед/мл;

Е 2 мкг/мл; К 0,1 мкг/мл, B+ 1 Mar/мл; гидрокортизон 0,4 мкг/мл. Клетки в концентрации 5. 10 кл/мл засевают

5 на подложку из человеческого коллагена и культивируют во флаконах Карреля при условиях, описанных в приме ре 1. На седьмой день культивирования получен газон эпидермальной культуры (5 10 кл/см подложки), эту

5 культуру клеток вместе с подложкой переносят на гранулирующую ожоговую поверхность этого же больного подложкой вверх. Через три дня наблюдают прикрепление нанесенных клеток эпидермиса и образование нового эпидермального покрова на месте посадки культуры клеток. Коллагеновая под- ложка лизируется эксудатом ожоговой раны.

Пример 3. Исходную суспензию клеток эпидермиса получают, как описано в примере 2, из лоскута кожи, взятого со здорового участка кожи больного и стимулированного помещением его в среду Игла, содержащую 20% эмориональной сыворотки человека, 0,1 ед/мл инсулина и 0,1 ед/мл С Г при 37 в течение 12 ч.

Полученные исходные клетки эпидермиса ресуспендируют в питательной среде следующего состава: среда 199;

10Х плацентарной сыворотки; 2Х плацентарного экстракта; витамины: А

4 ед/мл; Е 2 мкг/мл; К 2 мкг/мл;. В

0,1 мкг/мл, гидрокортизон 0,4 мкг/мл,,культивируют по флаконах Карреля на

Ъ подложке из человеческого коллагена при условиях, описанных в примере 1.

На восьмой день культивирования получен газон эпидермальных клеток (5 10 кл/см подложки), которые

5 трансплантируют этому же больному, как описано в примере 2. Наблюдают прикрепление и рост трансплантированных клеток на четвертые сутки после помещения их на ожоговую поверхность.