@ -нитроанилид @ -пироглутамил- @ -фенилаланил- @ -аланина- хромогенный субстрат тиоловых протеиназ
Иллюстрации
Показать всеРеферат
п-Нитроанилид L-пироглутамилЬ-фенилаланил-Ъ-аланина CH2-CH-CO-lv3H CH-CO--NH-CH-CO-NH-/ -KO Н2Сч xNH хромогенный субстрат тиоловых . протеиназ.
СОЮЗ С08ЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (19) (И) (Я) 4 С 07 К 5 08 (21) 3762288/23-04 (22) 02.07.84 (46) 15.12.85. Бюл. У 46 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) В.М.Степанов, Е.H.Ëûcoãoðñêàÿ, И.Ю.Филиппова, Е.С.Оксенойт и Л.А.Люблинская (53) 547.964.4.07(088.8) (56} Мо1е J.E., Horton Н.К.
Kinetic of Papain-Catalyzed
СНГСН-CO-Ин-СН-СО-НН-СН-СО ЖН / И02
Няс- NH
С сН сн сн, It
hydrolysis of И benzoyl-Larginine-p-nitroanilide.
Biochemistró, 1973, 12, Ф 5, 816.
Love G. The Cysteine Proteinases.
Tetrahedron, 1976, Д2, 291, (54)п-НИТРОАНИЛИД L-ПИРОГЛУТАМИЛL-ФЕНИЛАЛАНИЛ-L-АЛАНИНА — ХРОМОГЕННЫЙ СУБСТРАТ ТИОЛОВЫХ ПРОТЕИНАЗ. (57) и-Нитроанилид L-пироглутамилL-фенилаланил-L-аланина.- хромогенный- субстрат тиоловых.протеинаэ.
1198082 2 могенному производному пептида формулы
СН2 — СН-С0-ИН-СИ вЂ” CO NH — СН вЂ” СО NH NO
1 I
H6 - NH СН, С
С Э!! ,,0которое ьвжет найман применение в качестве субстрата для определения активности протеолитических ферментов, относящихся к класс тиоловых протеиназ, в энзимологии, медицине, биохимии, микробиологйи.
Цель изобретения — поиск новых хромогенных субстратов тиоловых протеиназ пептидного строения, .обладающих более высокой специфичностью к этому классу ферментов.
Пример. 154 мг (0,53 ммаль) бромгидрата п-нитроанилида Е-аланина растворяют в 2,0 мл 0,2 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,9, добавляют 0,53 мл 1 M раствора триэтиламина в диметилформа щце и 154 г (0,53 ммоль) метилового эфира L-пироглутамил-Ь-фенилаланин и 1 мг химотрипсина. Через 2 мин выпадает обильный осадок, который оставляют на 1 ч при ZO С и на 10 ч при 4 С. Затем промывают на фильтре 1 н. соляной кислотой и водой. Сушат в вакуумэксикаторе над щелочью. Выход 173 мг, (70X). Т.пл. 126-128 С, t.сС . -"-18 (c=1, диметилформамид). Чистота препарата определялась методом ТСХ на пластинках марки Silufol К =0,61 (бутанол-уксусная кислота-вада
200:35:70), R =0,91 (этилацетатпиридин-вода-уксусная кислота
300:18:68:32), R =O,81 (бутанолуксусная кислота-пиридин 15:3: 12: 10).
Аминокислотный анализ. Определено:
Glu 1t,2 нмоль (1,08), А1а 10,3 нмоль (1,00)„ Pb е 10,4 нмоль (1,01)
Вычислено: Glu 1; Ala 1; Ph е 1.
Синтезированный и-нитроанилид
L-пироглутамил-Ь-фенилаланил-L-аланина используется для определения протеолитической активности тиоловых протеиназ. При гидролизе субстрата тиоловыми.протеиназами проВНИИПИ Заказ 7686/26 Тираж 353 Подписное филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4
Изобретение относится к новому хроисходит выделение п-нитроаннлина и наблюдается линейная зависимость изменения оптической плотности при
410 нм от количества фермента.
Определение активности ферментов
t5 проводится по следующей методике.
К 1,8 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,3 М КС1, 0,1 мМ ЭДТА, 0,3 мМ дитиоэритрита добавляют 50 мкл раствора субстрата в диметилсульфоксиде (концентрация
10 мг/мл), термостатируют 5 мин о при 25 С и добавляют 0, 1 мл раствора фермента в том же буфере. Через
10 мин реакцию останавливают добавлением 0,2мл 1 н. НС1 и измеряют оптическую плотность при 410 нм.
Значения удельной активности ферментов в мкмоль субстрата на оптическую единицу фермента в минуту составили для папаина 910, для фици30 на 380, для бромелаина 200. Удельная активность того же препарата папаина, определенная по N-бензоил-L-ар-. гинин п-нитроанилиду, составила 4.
Препараты фицина и бромелаина не рас35 щепляли стандартный субстрат даже .в течение суток.
Таким образом, удельная активность папаина по предлагаемому субстрату в 227 раз выше, чем по
40 стандартному субстрату N-бензоилL-аргинин п-нитроанилиду.
Константы Михаэлиса (К„), рассчитанные по методу Эди-Хофсти, составляют 0,72 для папаина, 0,53 для фи45 цика, 0,57 для бромелаина. Для субстрата й-бенэоил L — àðãèíèí п-нитроанилида К =3 для папаина. Таким н образом, папаин имеет в 5 раз лучшее значение К по и-нитроанилиду
50 L-пироглутамил-L-фенилаланил-L-апанину, чем по и-нитроанилиду Н-бензоил-L-аргинина.