Способ проведения иммуноферментного анализа

Способ проведения иммуноферментного анализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

»»» ЮМ

РЕСПУБЛИК

0% 01) .

0,2-0,4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОР

И ОТКРЫТИ (21) 3724704/28-14 (22) 13.04.84 (46) 23.01.86. Бюл. Ф 3 ,(71) Самаркандский медицинский институт им. И.П. Павлова (72) Д.М. Ивницкий, М;Ф. Юлаев, Д.М. Аронбаев, А.П. Кашкин, А.М. Егоров, Б.Б. Дзантиев и С.Д. Варфоломеев (53) 615.375(088.8) (56) Clin Chem. 28,9, р.1848-1851 (1982). (54)(57) 1. СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА, включающий ин. кубацию определяемого и меченого анЩ14 A 61 K 39/00 6 01 и 33/53 тигена или антитела с иммуносорбентом и электрохимическое определение концентрации ферментной метки, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности, упрощения и сокращения времени исследования, электрохимическое определе« ние осуществляют по продукту перокси даэного окисления йодид-,ионов перекисью водорода при рН 3,8-4,2.

2. Способ по п. 1, отличаюшийся тем, что, йодид-ионы берут в концентрации, ммоль:

Иодид-ионы 0,75-1,5

Перекись водорода

1 1205913 1

Изобретение относится к медицине центрации пероксидаз и биологической химии, в частности кера) наблюдается в к иммуноферментным способам опреде- центраций 1 10 — 1

-11 ления биологически активных веществ циент чувствительнос в сыворотке крови или другом биоло- 5 .1:10 мкА/ммоль. Числ з гическом материале, и может быть руемых с помощью про использовано в клиникодиагностичес- метрического датчика ких лабораториях и предприятиях Мин- Предложенный спос медпрома. делять до 25 нг/мл а

- о

Цель изобретения - повышение чувст- 1 0 (" 2 ° 1 0 М) в сыворот вит ельности, упрощение и сокращение 50 мкл, дает возможн времени исследования при детектиро- в кинетическом режим ванин результатов иммуноферментного жает время измерений анализа.. Результаты опреде

Способ осуществляется следующим 15 зы в модельных раств образом. табл.J

Иммуноферментное определение Пример. Имму аспарагиназы. деление кроличьих ан

Количественное определение аспа- руса Х-картофеля. рагиназы проводят- прямым конкурент- 20 В основу метода и ным методом. В лунки планшетов для метод, который осуще иммунологических, реакций вносят по дующей схеме. 0,2 мл

100 мкл ф-глобулиновой фракции ан- го вируса (100 мкг/м тител против аспарагиназы содер- жи полистироловых пл

У о жащей 0,1 мг/мл белка. Планшеты ин- 25 ПРи 4 С в течение 18 кубируют 18 ч при 4 С, затем прово- аза 0,01 М калий-фо дят пятикратную промывку забуферен- при РН 7,4, содержа

11 ft ным физиологическим раствором при гента Твин-20 . Пос

В лучики содержащие иммо кУбиРУют иммобилизов

,50 мкл анализируемой пробы и коньюгата аспарагинаэы с пероксидазой, со- затем с меченой пе ответствующего 10 мкг/мл нативной, фракцией ослиной ант пероксидазы После трехчасовой HHKó ро ки (5000 н / ). бации при 37 С лунки опять отмывают

35 процессе анализа про физиологическим раствором при РН 7, 4, калии ф ф ым содержащим неионный детергент О, 1 M хлористый натр (0,05Х тритона Х вЂ” 100). В отмытые гента "Твин-20" ° Пос лунки вносят по 150 мкл субстратной чество сорбированног смеси содержащей 0 2 ммоль перекиси ного комплекса опред

Э 1 40 водорода и 0,75 ммоль иодистого ка- чески. В лунки добав лия, приготовленной в Q 1 И натрий- стРатной смеси, соде ацетатном буфере при РН 3,8 с 0,1 M перекиси водорода и 1 добавкой хлористого калия. После стого калия, пригото

15-минутной инкубации при комнатной натРий-ацетатном бУф

45 температуре 100 мкл пробы с помощью 01М .добавкой хлорист ,автоматического микродозатора вводят .15 минутной инкубаци в проточный амперометрический датчик. температУре

В датчике продукт ферментативной реакции — молекулярный иод, электровосстанавливаясь на поверхности индикаторного электрода, вызывает появление тока во внешней цепи датчика, о величина которого пропорциональна концентрации связанной с твердой фазой пероксидазной метки.

Установлено, что линейный участок зависимости катодного тока от коны (фермента-маринтервале кон10 М; Коэффити около о проб, анализиточного амперв 1 ч, равно60-80. об позволяет опреспарагиназы ке крови объемом ость работать е и в 3-5 раз сни1 ления аспарагинаорах приведены в ноферментное опретител против виоложен сэндвичствлен по слепробы очищеннол) вносят в лунат, инкубируют ч. Отмывают три сфатным буфером щам 0,05Х детерледовательно ин- анный препарат ниями исследуеС в течение 1ч, роксидазой JgG икроличьей сывоОтмывку лунок в водят 0 01 N ром, содержащим ий и 0,05Х детерле отмывки колио иммуноферментеляют амперметриляют 150 мкл субржащей 0,4 ммоль ,5 ммоль иодивленной в 0,1 М ере при 4,2 с ого калия. После и при комнатной робы с помощью автоматического микродоэатора вводят в проточный амперометрический датчик.

Результаты, полученные предлагаемым способом, сравнимы по чувствитель ности с даннымиспе трофотометоичес кой регистрациии .значительно проще.

Сравнительная характеристика электрохимических способов проведения им" муноферментного анализа (ИФА) представлена в табл, 2.

1205913

Таблица

Концентрация аспарагиназы, нг/мл т Найдено, n=6

Ошибка определения, 7.

Введено

120

217

58,5

+2,5

Таблица 2

Способ проведения ИФА с электрохимической детекцией

Сравниваемый параметр предлагаемый известный

НАДН вЂ” -HAP +2е +Н (окисление) J<+ 2е -«2 J (восстановление) Индикаторная реакция

Двухэлектродная система с гальваническим

Трехэлектродная система с наложенным потенциалом

+0,75В.отн.

Ag/AgC1

Тип электрохимической ячейки режимом т

5.-10 -5 10 моль/л (по J1) -t -5

8,7 ° 10 — 1,75.10 моль/л (IIo НАДН) Нижний предел опреде- С н = 0,025 мкг/мл ления антигена (антител) (L аспарагиназа) CH= 2,5 мкг/мл (фенитоин) 40 с

180 с

Время измерения

Составитель В. Дроздов

Техред М.Надь

Корректор С. Шекмар

Редактор А. Козориз

Подписное

Заказ 8583/7

Тираж

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7(-35, Раушская наб., д. 4/5 о

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Диапазон определяемых концентраций продукта ферментативной реакции

Коэффициент чувствительности

Нижний предел определения фермента-маркера

116 + 7

225+ 11

60+ 5

С„= 1 ° 10 М или 0 5 нг/мл пероксидазы

-3,4 у

+3,6