Способ определения @ -амилазы

Способ определения @ -амилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.

ОПИСАНИЕ ИЗО6РЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

Г

4 и

0Н

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbITHA (21) 2662348/28-13 (22) 04.09.78 (3 1) P 2755803.8 (32) 14.12.77 (33) DE (46) 15.02.86. Бюл. Ф 6 (7 1) Берингер Маннхайм ГмбХ (ЭЕ) (72) Элли Раушер, Ульрих Нойманн, Аугуст Вильхельм Валефельд, Александер Хаген, Вольфганг Грубер, Йоахим

Цигенхорн, Ойген Шаих, Ульферт Денеке, Герхард Михал и Гюнтер Вайманн(ВЕ) (53) 577. 15 (088. 8) (56) Ceska M., Birath К., Brown В., Clin. Clim. Acta, 1969, 26, 437-444.

Патент США В 3879263, кл. 195-103.5, опубл. 1975. (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРКДЕЛКНИЯ (-АМИЛАЗЫ путем энзиматической реакции с субстратом при рН 5,6-8,0 и измерения количества образующихся продуктов, о т л и.ч а ю шийся тем, что, с целью повыщения точности определения, в качестве субстрата используют соединение общей формулы (1)

СН2,0Н где R — глюкозидная, фенилглюкозидная, мононитрофенилглюкозидная, сорбитная или глюконокислотная группа.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют О, 1250 ммоль/л соединения общей формулы (I) . (19) (И) (59 4 G 01 N 33/48 С 12 1/40

3. Способ поп. 1, отличаюшийся тем, что при измерении количества продуктов реакции на них воздействуют oL -глюкозидазой.

4. Способ по и. 1, отличаюшийся тем, что используют соединение общей формулы (I), где R— глюкозид, и при измерении количества прсп уктов реакции на них воздействуют мальтозофосфорилазой, затем фосфоглюкомутазой с последующим воздействием глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой в присутствии никотинамидадениндииуклеотида (НАД)

5. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют соединение общей формулы (1), где К— фенилглюкозидная группа, и измерение количества продуктов реакции ведут С„ при добавлении 3-фенил-6-сульфонилбензтиазолонгидрозона и монофенолоксидазы.

6. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют соединение общей формулы (I), где R— сорбитная группа, и измерение количества продуктов реакции ведут при добавлении сорбитдегидрогеназы и HA(i с последующим, в случае необходимости, введением соли тетразола и диафоразы, 7, Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют соединение общей формулы (I) где R— группа глюконовой кислоты, и измерение количества продуктов реакции ведут при добавлении глюконаткиназы, дегидрогеназы 6-фосфоглюконовой кислоты и никотинамидадениндинуклеотидфосфата.

1212332

Изобретение относится к микробиологии, а именно к методам определения с -амилазы.

Цель изобретения — повышение точности определения. 5

На чертеже показаны графики, полученные по результатам ряда разбавле« ний человеческой сыворотки физиологическим раствором поваренной соли.

I 10

CHz0H

Ц, (r) 25

<-глюкозидаза

3 глюкоза

Мальтотриоза + 2Н О с -глюкозидаза

Мальтотетроза + ЗН О 4 глюкоза

НК

7 глюкоза + 7 ATP 7 глюкоза-6-Р

+ глюконат-6-P + 7 NADH + 7Н положении, например в виде 2,4-,2,6или 3 5-заместителей.

При отщеплении заместителей, содержащих нитрогруппы, освобождающиеся нитрофенолы или динитрофенолы сами являются окрашенными соединениями и их можно определить оптически. Если отщепляется сам феиол, то его можно определить по известным методам, например путем взаимодействия с нуклеофнльным.агентом, таким как

3-метил-6-аульфонил-бензтиазолон-гид- . разон-(2) (НЗК) в присутствии моно фенолоксндазы. При этой реакции по50 лучают красный краситель, который можно определить оптически.

При отщеплении сорбита, например, путем окисления с помощью сорбит.дегидрогеназы во фруктоэу NAD восста55 навливается в NADH. Образование последнего можно определить при помощи

УФ-спектрофотометра или путем взаимодействия с солью тетразола, наприСпособ осуществляют следующим образом.

Определяют oL -амилазу путем проведения знзиматической реакции о — амилазного субстрата при рН 5,6-8,0 и измеряют количество продуктов реакции, при этом в качестве субстрата используют соединение общей формулы сС -амилаза

Мальтогептоза + Н О

7 глюкоза-.6-P + 7 NAD

6PDH

} . При выполнении способа используют производные мальтогептоэы, т.е. соединения общей формулы (t), в которой

R не является глюкозидной группой, При воздействии обоих энзимов <а амилазы и и -глюкозидазы заместитель, т.е. фенильная группа, мононитрофенильная группа, или динитрофенильная группа, или концевой сорбитный, или глюконовый остаток, отщепляются и могут легко определяться. Фенильные .. группы могут стоять в ас -или Р --положении. Если фенильные группы в 0 -положении, то их отщепление происходит под действием g, -амилазы и с6 -глюкозидаэы. Отщепленные, замещенные или неэамещенные фенолы определяют по известным цветным реакциям (для P —положения наряду с к -глюкоэидазой дополнительно применяется Р -глюкозидаза) .

При динитрофенильных остатках обе нитрогруппы могут быть в любом где R — глюкозидная, фенилглюкозидная, мононитрофенилг люкозидная, сорбитная или глюконокислотная группа.

В качестве субстрата а -амилаэы можно применять мальтогептозу и определенные ее производные, образующие при воздействии ос --амилазы производный продукт расщепления, который может быть особо определен.

Способ пригоден при определении продуктов расщепления с помощью oC —глюкозидазы или мальтозофосфорилазы.

При определении с Ы -глюкозидазой и соединением общей формулы (1) с

К равно глюкозиду продукты расщепле ния мальтогептозы, мальтотетрозы и мальтотриозы расщепляются далее в глюкозу и последнюю определяют известным образом. Для измерения образовавшейся глюкозы в присутствии с4— глюкозидазы предпочтительным является гексокинозный способ. Выполнение „ предлагаемого способа представлено следующими уравнениями: мальтотриоза + мальтотетроза, 12332

Иальтотриоза + мальтотетроза — н.,мальтоза; мальтоэофосфорилаза глюкоза + -глюкоза 1-Р;

Иальтоза + PO "

Р-Р-6-lum

11-Глюкоза-1-р глюкоза-6-Р, G6PDH

Глюкоза-6-P + NAD глюконат-6-P + NADH + Н

Глюконат 6-P + NAD ††- рибулоза-6-P + NADH + Н

6PGDH

Ф з 12 мер TNT(2-(пара-иодфенил)-3-(паранитрофенил-тетразолхлоридом), в присутствии диафоразы или другого передатчика электронов, образующийся окрашенный формазан определяют оптически в видимой области спектра, Аналогичным ббразом можно определить выделенную глюконовую кислоту, например, с глюконаткиназой, дегидрогеназой 6-фосфорглюконовой кислоты и NADP а также с солью тетразола и передатчиком электронов.

Для осуществления способа необходимо поддерживать рН среды 5-9, предпочтительно работать при рН 7-7,5 (лучшие результаты и сокращается время реакции). В случае применения нитрофенильных соединений рН составляет 6-8,5.

В качестве буферов применяют такие соединения, которые активны в области главной активности применяемого энзима. Предпочитаются фосфат, HEPES (N-2-гидроксиэтил)-пиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) и глицилглицин, предпочтительны концентрации 10-200 ммоль/л. с6-Глюкозидазу применяют в количествах от О, 1 до 5000 Н/мп. Преимущество способа состоит s возможности применять сравнительно большие копи -амилаза

Иальтогептоза + Н20 чества этого энзима,, так что н6 -амилазное расщепление является стадией, определяющей скорость.

Соединение формулы (1) берут в количествах от О, 1 до 250 ммоль/л, предпочтительно 0 5-100 ммоль/л.

Насыщение субстрата Ы -амилазы мальтогептозой происходит при концентрации от 8 до 10 ммольз Поэтому целесообразнее применять минимальную концентрацию мальтогептозы (8 ммоль).

Кроме того, целесообразно добавлять активирующее вещество для ос -амилазы,-предпочтительнее хлористый натрий или хлбристый калий.

Определение продуктов расщепления производят путем взаимодействия их с мальтозофосфорилазой, вследствие чего образуется глюкоза-1-фос о фат, который затем определяют известным способом, предпочтительнее превращать глюкоза-1-фосфат в глюкоза-6-фосфат с NAD в присутствии глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы с образовани2 " ем глюконат-6-фосфата и NADH причем образование последней контролируют фотометрически. Сигнал измерения может быть усилен путем дальнейшего окисления с ЙАЭ в присутствии рибулоэо-5-фосфата и еще одной молекулы.

Выполнение способа поясняется следующими уравнениями:

Преимущество этого варианта выполнения способа состоит в том, что мальтозофосфорилаза специфичнее, чем к -глюкозидаза и поэтому не вредит эндогенной глюкозе.

Способ с использованием ас -глюкозидазы осуществляют аналогичным образом.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Иальтогенный метод (<-глюкозидазная система).

Смесь реагентов, содержащую кглюкозидазу, С6РЭН, НК, NAD, АТР, мальтогептозу, Ия, NaC1 и фосфатный буфер, растворяют в 2,0 мл дистиллированной воды. Устойчивость реагента при комнатной температуре составляет около 1 ч,при температуре ниже 8 С 6 ч.

Полученный раствор имеет следующие концентрации реагентов..

Фосфатный буфер 50 ммоль/л, рН 7,0

NaC1 50.ммоль/л

Ng2+ . 2 ммоль/л

Иальтогептоза 10 ммоль/л

АТР . 1,2 ммоль/л

55 КАР 2 ммоль/л

НК Ъ2 U/ë

G6PDH ъ 2 U/ë

Ф-Глюкозидаза МО U/ë

1212332

Полученный раствор инкубируют при

30 С, смешивают с пробой и определяют в фотометре разницу экстинкции при 334 нм Hg. После 10-минутной фор-50 инкубации экстинкцию определяют в течение 10 мин. Для,2,0 мл реагента и О, 10 мл пробы получают следующую формулу для вычисления:

2 1х1000

6,18х 0,1 х0,2

Раствор при 25 С смешивают с

0,02 мл пробы сыворотки и заливают в кювету слоем толщиной 1 см, затем. определяют экстинкцию при 365, 340 нли 334 нм в фотометре. Экстинкцию отсчитывают через 10 мин и.затем через промежутки в одну минуту отсчет повторяют пять раз.

Из вычисленных разниц экстинкции в минуту (ЬЕ/мин) выводят среднюю величину, вычитают величину индукции реагента,и скорректированную величину используют в расчетах.

Расчет производят следующим образом.

U/ë 25 С = 4244 х дЕ 365 нм/мин

= 2290 х ьЕ 340 нм/мин = 2235 х х ьЕ 334 нм/мин.

На графике показаны результаты ряда разбавлений человеческой сыворотки физиологическим раствором поваренной соли, полученные по данному методу.

Если реагент делят на две загруз-; ки, из которых одна содержит мальтогептазу, другая: — смесь остальных реагентов, то стойкость таких растворов может увеличиваться, Для смеси

0 реагентов при температурах до 8 С . она составляет 30 ч, при комнатной температуре 8 ч. Стойкость мальтогептозы составляет 6 и 1 неделю соответственно.

Пример 2. Определение мальтозофосфорилазной системой, Готовят два реагента: первый, состоящий из амилазного субстрата, второй — из мальтозофосфорилазной системы. Первый реагент содержит мальтогептозный субстрат, второй — растворимый крахмал. Концентрации реагентов после растворения в воде следующие (см. табл. 1).

= АЕ/мин х 1699 U/ë, При применении пяти различных человеческих сывороток с укаэанными реагентами получают следующие величины (см. табл. 2).

Hp и м е р 3. Определение otамилазы с фенил-о -мальтогептозидом в качестве субстрата.

Фенил-e(,-мальтогептоэид расщепляетI0 ся ()а -амилаэой на феннл-()!-иальтотриид- или тетраид, которые а -глюкозидазой превращаются в фенол и глюкозу.

Освободившийся фенол монофенолоксидазой с нуклеофильным реагентом

15 3-метил-6-сульфонил-бентриазолон-гидразон-(2), окисляясь, превращается в красный .краситель, скорость образования которого пропорциональна активности амилазы в пробе и мо20 жет определяться фотометрически.

Испытания. а) Фенил-Ы-мальтогептозид+Н О—

-амилаза феиил-и-.р-три(тетра)-глюко25 пиранозид + мальтотетра-(три)-оза, б) Фенил-ec-D-три-(тетра)-глюкопи+ 3(4)„ О ()(-глюкозидаза нол + 3(4) глюкоза. в) Фенол + Н$К + О монофенолок30 сидаэа краситель + 2Н 0.

2 О

Условия измерения: 25 .С, длина волны 492 нм,кювета 1 см.

Состав реагента приведен в табл.3.

35) Вместо фосфатного буфера используют глицин, глицилглицин, гепес, трис-, тра-. и другие буферы.

Пример 4. Определение пас†амилазы с пара-нитрофенил-мальтогептозидом. Испытания.

Ф пара-Нитрофенил-а-мальтогептоэид (глюкоза) + пара-.ик итра4е )

Ф-глюкозидаэа

45 нил-oL-глюкоза„. „(глюко- за + пара-нитрофенол).

После расщепления мальтогептозида продукты расщепления разлагают на глюкозу и пара-нитрофенол. Пара-нитрофенолят-анион в щелочном растворе окрашен в желтый цвет и может быть определен оптически.

Испытания.

О

Смесь реагентов: 50 ммоль/л фосфатного буфера, рН 7,4; 50 ммоль/л ,хлористого натрия, от 5 до 50 П/мл ()(.- глюкоэидазы; от 5 и/или 10 ммоль/л пара-нитрофеннл-()(-мальтогептоэида.

1212332

Количество: 1 мл смеси реагентов +

+ 50 U/ë пробы, температура 30 С, длина волны 405 нм. Начало реакции сыворотки после достижения температуры измерения (10 мин предваритель ной инкубации сыворотки).

Пример 5. Определение a6амилазы с мальтогептитом.

Испытания.

Ы -амилаза

Мальтогептит + Н О MaJIbтотриит + мальтотетроза. Мальтотри-.

:ит + Н Р в4-глюкозндаэа

2 сорбит +

+ мальтоза. Сорбит + NAD + — фрукSDH тоза + NADH + Н . NADNH + 1NT + Н+- диафораза + формазан + NAD . SDH =

= Сорбитдегидрогеназа.

Испытуемая . система представлена в табл. 4.

Начало реакции добавки пробы при

492 нм и 25ОС.

Таблица 1

Количество, используемое при осуществлении способа

Реагенты известного предлагаемого

20 мм

20 мм

2 мм

Мальтогептоза

10. мм

Растворимый крахмал

5 мг/л

Следы

Глюкоза-1, 6-дифосфат

Мальтозофосфорилаза микроорганизмов

3 U/мл

3 О/мл -Фосфоглюкомутаза (микроорганизмов) G6PDH (Leuconostoc

mesent) 9 U/мп

6PGDH (Leuconostoc

mesent) 1 U/мл.

Фосфатный буфер, рН 6,5

Пример 6. Определение а —амилазы с мальтогептаглюконовой кислотой

Испытания.

Мальтогептоглюконовая кислота +

sc-амилаза

+Н О мальтотриоглюконовая кислота + мальтотетроза.

Мальтотриоглюконовая кислота + м - глюкозидаза

tH20 глюконовая кислота + мальтоза. глюконатГлюконовая кислота + АТР киназа — — -.;1 глюкоиовая кислота-6-Р + ADP„

1 Глюконовая кислота-6-Р + NADP +

6-фосфоглюконовая кислота

+ рибулодегидрогеназа за-5-.Р + NADPH + СО + Н.

Испытуемая система дана в табл. 5.

Проба сыворотки: измерение проводят при 340 или 365 нм и 25 С, объем

3,00 мл.

1212332

Таблица

Та блица 2

Концентрация прн испытании

Сыворотка рахмал, U/ë

Фосфатный буфер, рН 7,4

0,05 моль/л

Хлористый натрий

Фе нил-ec-D0,05 моль/л

37,4

15,3

-мальтогептозид

27,3

10 ммоль/л

1 ммоль/л

61,2

HSK

15 Монофенолоксидаза

39,1

95,1

1 U/ìë

10 U/ìë

114 ас-Глюкозидаза

Испытываемый

20 объем 2,0 мл

374

Таблица 4

12,8 ммоль/л РО

1,92

6,4 ммоль/л

1,0. ммоль/л

0,01

3,3 ммоль/л

0,10

1,0 ммоль/л

0,09 ммоль/л

NAD c = 40 Mr/wr

0 05

INT с = 0,6 мг/мп

0,20

0,05

0,10

0 05

0,30 м -Глюкозидаза

1120 U/ìë

74670 U/ë

0,20

Проба сыворотки (Пресинорм U711) 0,02

Предлагаемое соединение, U/ë

Na-(К-РО -буфер

0,02 моль/л + тритон х 100 2 мл/100 мл

+ NaC1 10 ммоль/л, рН 6,9

MgCl2 0,3 моль/л

Мальтогептит 100 ммоль/л

Диафораза (Clostr.

K1uyveri) 5 мг/л

ATP с = 50 Mr/èë

Гексокиназа 280 U/ìë"

SDH 180 U/ìë

Ф

Реагент в буферном растворе теста.

167 U/ë

3,29 ммоль/л

4666 U/ë

18000 U/л

1212332 Таблица 5

Реагенты

Концентрация при испытании

Na-(К-РО )-буфер

0,02 моль/л

14,6 ммоль/л фосфата

2,19

0,01

Мальтогептаглюконовая кислота 150 ммоль/л

О, 10

NaDP с = 10 мг/л

ATP с = 50 мг/л

Глюконат-киназа 40 U/ìë

6-фосфоглюконовой кислоты 0,03

f066 U/ë

Дегидрогеназа 24 U/ìë

0,10 е - Глюкозидаза 1120 U/ë

0,30

001 д

etNAef

/гЗ45 7Дрщщ

Ю д 7 Ю Х 4 8 2 1 ЮН ФУуж.

VP мариф

Заказ 2527 Тираж 778 Поцписиое

Произв полигр пр тие, r. Ужгород ул Проек 4

+NaCl 10 ммоль/л, рН 6,9

MgCl . 1 моль/л

Содержание реагентов, мл

7,3 ммоль/л _#_aCl

3,3 ММОль/л

5 ммоль/л

0,38 ммоль/л

800 U/ë

11, 2х10 U/ë