Способ получения лимонной кислоты глубинным методом

Способ получения лимонной кислоты глубинным методом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111

ace(;q ÄÄ-, l ЕА. У д „„.„», ИМЦ1г»;,,„-, J3 ®E Y(0 П;:

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3545952/28-13 (22) 20. 12. 82 (46) 30.03.86. Бюл. Ф 12 (7 1) Ленинградский межотраслевой научно-исследовательский институт пищевой промьппленности (72) В.П. Ермакова, Е.Я.Щербакова, В.И.Кузьмин, А.А.Веселова, Т.В.Петрюк и В.M.Финько ,(53) 661.734.1(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

И - 659609, кл. С 12 Р 7/48, 1979.

Авторское свидетельство СССР

11 153707, кл. С 12 P 7/48, 1963. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОИ КИСЛОТЫ ГЛУБИННЫМ МЕТОДОМ, включающий посев спор гриба-продуцента

Aspergillus niger в условиях аэрации и перемешивания в посевной ферментатор, подращивание на мелас-: сном растворе кислотообразующего мицелия, ферментацию на мелассной среде в основном ферментаторе ивьщеление лимонной кислоты, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, для д114 С 12 P 7/48, С 12 R 1 685 подращивания мицелия используют мелассный раотвор с концентрацией сахара 4,5-6,0Х, при этом подращивание ведут в течение 24-36 ч для ферментации используют мелассную среду с концентрацией сахара 13-14%, ферментацию проводят в течение 4,55,5 сут., а на вторые и третьи сутки ферментации проводят долив стерильной воды в количестве 4-5% от объема среды, причем в качестве гриба-продуцента используют Aspergillus

niger Л-4.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью создания оптимальных условий для ферментации при использовании меласс с содержанием кальция свьппе 0,8%,в . мелассную среду вводят щавелевокислый аммоний в количестве, необходимом для осаждения 1/2 солей кальция, содержащихся в мелассе, и сернокисльж цинк в количестве 10-17 мг на 1 л мелассной среды, при этом общееколичество мелассной среды берут исходя из заполнения объема основного ферментатора на 70-75Х.

1221241

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к технологии получения пищевых органических кислот, в частности лимонной. кислоты, способом глубинной ферментации угле-,5 водсодержащего сырья, например мелассы, погруженной культурой микроорганизма — продуцента лимонной кислоты.

Цель изобретения — повьппение выхода лимонной кислоты и создание 1О .оптимальных условий для ферментации при использовании меласс с содержанием кальция свьппе 0,8%.

Способ осуществляют следующим образом. 15

Посевной мицелий в течение 2436 ч выращивают на среде из мелассы, содержащей 4,5-6Х сахара, в одну стадию: для ферментации подготавливают мелассную среду с начальной 20 концентрацией сахара 13-14%. В качестве ингибитора образования побочных кислот применяют сернокислый цинк в дозе, соответствующей 10-17 мг на литр среды. Объем заполнения фер- 25 ментатора 70-75Х. Увеличение концентрации свыше 6Х приводит к непроизводительному расходу сахара, дополнительным затратам сырья. Умеиьше" ние концентрации ниже 4,5% настолько 50 увеличивает период адаптации грибапродуцента в результате резкого перепада концентрации питательных веществ при переводе подрощенного мицелия в ферментированные растворы, что процесс становится нерентабельным.

Использование мелассной среды с высокой концентрацией сахара и одновременное заполнение объема ферментатора на 70-?5X позволяет использовать в одном цикле (без дополнительных подливов) до 7,5 т мелассы и, следовательно, получить высокий валовый выход лимонной кислоты с ферментатора. При использовании концентрированных мелассных сред, когда весь запас питательных веществ дается сразу, процесс адаптации и роста гриба происходит с первых суток, а затем идет активный биосинтез лимонной кислоты, увеличение титруемой кислотности без снижения до конца процесса.

Для обеспечения нормальной аэрации в ферментаторе эрлифтного типа и более полной утилизации субстрата, в процессе ферментации на 2-е и 3-и сутки производят долив стерильной воды в количестве 4-5% от объема ферментатора. Продолжительность ферментации 4,5-5,5 сут °

Необходимость доливов стерильной воды вызвана тем, что в результате испарения среды увеличивается вязкость растворов, возрастает концент-, рация продуктов метаболизма гриба, ухудшаются условия питания и газообмена. Доливы воды в количес,тве

4-5% от объема среды снимают эти негативные явления и улучшают условия кислотообразования. Выбранное время долива (2-е и 3-и сутки ферментации) наиболее благоприятно, так как именно в этот период в результате нарастания мицелиальной массы и высокой степени аэрации происходит значительное испарение среды и накопление продуктов жизнедеятельности гриба. При более позднем сроке начала доливов происходит снижение технологических показателей процесса. Прозводить долив воды на первые сутки нецелесообразно, так как гриб только начинает накапливать биомассу и любые операции, связанные с доливом, увеличивают вероятность инфицирования среды.

В качестве гриба-продуцента используют осмофильный штамм Aspergil(us niger Л-4 (штамм депонирован в

Центральном музее промьппленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером Г-171) .

Высокая исходная степень заполнения ферментаторов достигается в результате частичного (1/2) осаждения солей кальция щавелевокислым аммонием. Вследствие этого происходит сравнительно небольшое вспенивание среды, что позволяет сохранить необходимый уровень заполнения ферментатора на 70-75Х. При полном осаждении солей кальция возрастает содержание азота, что способствует накоплению побочных кислот, в частности щавелевой.

Дозировка ZnSO зависит от испольФ зуемых образцов мелассы, от доз ферроцианида кальция и щавелевокислого аммония, применяемых для обработки мелассы. Вещества, используемые для осаждения тяжелых металлов и солей кальция, не имеют избирательного действия и в процессе соосаждения выводят из раствора ряд необходимых микроэлементов, в том числе и Zn.

Экспериментально: установлено, что

1221241

ZnS0<, применяе и в дозе 10-17 мг на лйтр мелассной среды, дает возможность направить биосинтез в сторону максимального продуцирования лимонной кислоты за счет угнетания биосинтеза глюконовой кислоты при ферментации яелассных сред.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример. 1. Выращивание кислотообразующего мицелия и синтез лимонной кислоты осуществляли в лабораторных условиях на качалке типа

АВУ-50р с числом качаний 160 в минуту в колбах емкостью 700 см при о

32 С. В качестве продуцента использовали Aspergillus niger штамм Л-4.

Для подращивания мицелия приготавливали мелассную среду, содержащую 5Х сахара по следующему рецепту, г/л:

Иеласса 106,4

Щавелевокислый аммоний

Ферроцианид калия

Однозамещенный фосфат калия 0,16

Углекислый натрий безводный 0,146

Сульфат цинка водный 0,005

Сульфат магния водный 0,25

Готовую стерильную среду разливали в качалочные колбы по 50 мл и засевали суспензией конидий. Для приготовления суспензии 15 мг конидий замачивали в 10 мл мелассной среды, приготовленной для подращивания, и интенсивно стряхивали в течение

5 мин. Подращивание мицелия проводили

24 ч.

Для ферментации приготавливали мелассную среду, содержащую 13 сахара следующего состава, г/л:

Меласса 276,0

Ферроцианид калия 0,9

Углекислый натрий безводный 0,38

Однозамещенный фосфат калия

Сульфат цинка водный

2,11

0 35

Пример 2. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 1. Процесс ферментацни отличается от примера 1 тем, что приготавливаемый MeJIBccHbM раствор об рабатывали щавелевокислым аммонием в количестве, необходимом для осаждения половины солей кальция (из

0,38

0,38 расчета содержания Са + в мелассе в пересчете на СаО). Одновременно увеличивали в 2,0 раза количество вносимого сернокислого цинка по отношению к оптимальной дозе, установленной для разбавления сред, используемых в известном способе.

Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:

1р Меласса 276,0

Ферроцианид калия 0,9

Углекислыи натрии безводный

Щавелевокислый аммоний 2,73

Однозамещенныи фосфат калия 0,16

С ул ьфат цинк а водный 0,010

20 Результаты испытаний даны в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает на 18,7, а выход от сахара на 5,7Х по сравнению с прототипом.

Пример 3. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли так же, как в примере 2. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что приготовленный мелассный раствор обрабатывали щавелевокислым ,аммонием в количестве, необходимом для полного осаждения солей кальция

З5 (из расчета содержания Са + в мелассе в пересчете на СаО). Одновременно увеличивали в 2,0 раза количество вносимого сернокислого цинка по отношению к оптимальной дозе, уста4О новленной для разбавления сред, используемых в известном способе.

Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:

Иеласса 276,0

45 Ферроцианид калия 0,9

Углекислый натрий безводный

Щавелевокислый натрий, безводный 5,46

50 Однозамещенный фосфат калия 0,16

Сульфат цинка водный 0,01

Сравнивая данные, полученные при ведении процесса по предлагаемой

55 технологии, количество лимонной кислоты, полученное с,колбы, снижается на 10,8Х, выход от сахара на 12,4Х.

В растворе накапливается 25,8 щаве-.

122

0,09

1,26

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии ферментации концент-, рированных сред количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возросло

5 левой кислоты, тогда как по прототи. пу ее содержание составляет 11,9Х, а про предлагаемой технологии щавелевая кислота не синтезируется вообще (табл. 1).

Готовую среду разливали в качалочные колбы по 50 мл и засевали 10 мл подрощенного мицелия. Процесс ферментации длился 5 сут. С колбы получено

5180 мг общей кислоты, в составе 10 синтезируемых кислот лимонная кислота составила 96,37., глюконовая 3,77, щавелевая кислота отсутствовала, выход лимонной кислоты от сахара

71,25Х. 15

Контролем служил процесс, осуществляемый по технологии прототипа, при котором мицелий производственного штамма Aspergillus niger Л-4 подращивают на мелассной среде, 20 содержащей ЗХ сахара в течение 24 ч.

Подросшим мицелием в количестве

10 мл засевали ферментационную мелассную среду, содержащую ЗХ сахара.

Через 24 ч после засева бродильных 25 растворов подрощенным мицелием начинали доливы мелассного раствора

25 o-ного по сахару. Доливы проводили в два приема по 9,5 мл через 5 ч.

Мелассная среда для подращивания мицелия, г/л:

Меласса 63,8

Ферроцианид калия 0,21

Углекислый натрий безводный

Щавелевокислый аммоний

Однозамещенный фосфат калия 0,16

Сульфат цинка водный 0,005

Сульфат магния водный 0,25

Для ферментации среда приготавливается по тому же рецепту, что и для подращивания, но не вводят сульфат магния.

Мелассная среда для долива, г/л: 45

Меласса 532,0

Ферроцианид калия 17,7

Процесс ферментации длился 5 сут.

За процесс с колбы получено 5440 кг общей кислоты, в составе кислот лимонная составляет 79,8Х, щавелевая 11,9Х, глюконовая 8,37., выход лимонной кислоты от сахара 67,27.

1241 6 на 13,5%, а выход от сахара на 4,07., при этом в составе синтезируемых кислот отсутствует щавелевая кислота.

Пример 4. Процесс подращивания посевного осуществляли, как в примере 1. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что для ферментации приготавливали мелассный раствор 127.-ный по сахару.

Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:

Меласса 255,0

Ферроцианид калия 0.8

Углекислый натрий безводный 0,35

Щавелевокислый аммоний 2,5

Однозамещенный фосфат калия 0,16

Сульфат цинка водный 0,010

Из табл. 1 видно, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 5 4Х, а выход от сахара на 2,57.

Пример 5. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 1, Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что для ферментации приготавливали мелассный раствор с содержанием сахара 14Х.

Рецепт мелассной среды.для ферментации, г/л:

Меласса 298,0

Ферроцианид калия 1,0

Углекислый натрий безводный 0,41

Щавелевокислый аммоний 2,95

Однозамещенный фосфат калия 0,16

Сульфат цинка водный 0,10

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 18,?, Пример 6. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 2. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что количество вносимого сернокислого цинка в мелассный раствор равно оптимальной дозе, установленной для разбавленных сред {5 мг/л), Данные табл. 1 показывают, что при такой подготовке сред, усиливается синтез глюконовой кислоты и снижается био1221241

Меласса 46 .-ная

108, 7

7 синтетическая активность гриба, в результате количество лимонной кислоты, полученной с колбы, возрастает лишь на 2,7Х, а выход от сахара снижается на 4,5Х по сравнению с прототипом.

Пример 7. Процесс подращивания посевного мицелия и ферментацию осуществляют, как в примере 2 (табл. 1). Отличие состоит в том,. 10 что количество сернокислого цинка, вносимого в мелассную ферментационную среду, увеличивается по сравнению с оптимальной дозой, установленной для разбавленных сред, в 3,4 раза и составляет 17 мг/л. При такой подготовке сред гриб активно синтезирует органические кислоты, причем в основном лимонную кислоту (88,8 ), в результате количество лимонной кислоты 20 по сравнению с прототипом возрастает на 15,5Х, а выход от сахара на 3,7 (табл. 1).

Пример 8. Процесс подращивания посевного мицелия и ферментацию25 осуществляют, как в примере 2. Отличие состоит в том, что количество сернокислого цинка, вносимого в мелассную среду для ферментации, превы шает норму, установленную для разбав- 30 ленных сред, и составляет 15 мг/л.

При такой подготовке сред активность гриба повышается, увеличивается содержание лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот, в результате количество лимонной кислоты по срав35 нению с прототипом повышается на

16,2, а выход от сахара на 4,5Х (табл. 1).

Следовательно, при обработке ме40 лассных сред повышенной концентрации

ШКА (в дозе, необходимой для выведения половины солей кальция, содержащихся в мелассе) доза вносимого сернокислого цинка должна быть увели45 чена по сравнению с дозой, установленной для разбавленных сред, и составляет 10-17 мг/л.

Пример 9. Культивирование осуществляли в производственных усло50 виях. В качестве продуцента использовали осмофильный штамм Aspergillus

niger Л-4. Для подращивания мицелия приготавливали 3 м мелассной среды, содержащей 5Х сахара.

Состав среды для подращивания мицелия, г/л: по сахару

Щавелевокислый . аммоний 3,66

Ферроцианид калия 0,46

Сульфат магния 0,23

Фосфорнокислый калий 0,116

Сульфат цинка, гидрат 0,01

Фур ациллин 0,017

Мелассу разбавляли в 2 м горячей воды в варочном котле и кипятили

10 мин. Затем добавляли щавелевокислый аммоний, кипятили 5 мин, вносили ферроцианид калия и кипятили еще 5 мин. После внесения сернокислого магния раствор через стерилизационную систему подавали в посевной ферментатор емкостью 5 м . В мелас-. сный раствор, охлажденный до 38 С, вносили стерильные растворы питательных солей фосфорнокислого калия и сернокислого цинка и антисептик фурациллин. Засев среды производили конидиями гриба в количестве 3 r предварительно (за 6 ч до посева), замоченных в мелассной среде того же состава.

Ферментацию проводили в 50 м ферментаторе на среде, содержащей

13 сахара.

Состав среды для ферментации, г/л:

Меласса 46 -ная по сахару 282,0

Щавелевокислый аммоний 3,33

Ферроцианид калия 1,03

Фосфорнокислый калий 0,106

Сульфат цинка, гидрат 0,02

Раствор. приготовленный в 50 м ферментаторе, засевали мицелием гриба Aspergillus niger штамма Л-4, выросшим в посевном ферментаторе за 24 ч.

В процессе ферментацчи мелассный раствор не подливали. В связи с тем, что в процессе ферментации происходит испарение, производят долив стерильной роды дважды по 2-2,5 м, обеспечивая лучшее эрлифтное перемешивание и более полное усвоение субстрата.

В процессе ферментации соблюдали следующий режим аэрации: первые 3 ч на ферментатор подают 200-300 мэ в час воздуха, через 3-6 ч 300-600 м в час, через 12 ч 600-800 м в час, 1221

40

9 через 20 с 800-1000 м в час и через сутки 1100-1200 м в час. На этом уровне аэрацию сохраняли до конца цикла.

Процесс ферментации заканчивают при содержании сахара в ферментируемой среде 0,2%. Длительность ферментации 4,9 сут.

Контролем служил процесс, осуществляемый по известному способу, 10 принятому за прототип, на разбавленных средах, при котором в качестве продуцента применяли производственный штамм Aspergillus niger Л-1.

Результаты представлены в табл. 2. 15

При ведении процесса по предлагаемой технологии за цикл с ферментатора получено 3014 кг лимонной кислоты. В составе синтезируемых кислот содержалось 88,3% лимонной 20 кислоты и 11,6% глюконовой кислоты, щавелевая кислота не синтезировалась.

Съем лимонной кислоты составил

11,2 кг с 1 м в сут, выход лимонной кислоты от сахара мелассы

73,6%. Для получения. 1 т лимонной кислоты затрачено 2952 кг 46Х-ной по сахару мелассы.

При ведении процесса по прототипу за 5,0 сут с ферментатора по- 30 лучено 2748 кг лимонной кислоты. В составе синтезируемых кислот содержалось 85,9Х лимонной кислоты, 10,0Х щавелевой кислоты и 4,1% глюконовой кислоты. Съем лимонной кислоты с 1 м в сут 10,0 кг, выход лимонной кислоты от сахара мелассы

77,4Х ° На получение 1 т лимонной кислоты затрачено 2808 кг 46Х-ной по сахару мелассы.

Пример 10. Процесс осу, ществляют, как в примере 9, Отличие состоит в том, что долив стерильной воды начинают с третьих суток. По результатам, представленным в 45 табл. 2, видно, что при таком веде241 10 нии процесса по сравнению с прототи- пом сокращается длительность цикла, увеличивается съем лимонной кислоты, однако значительно снижается выход от сахара.

Пример 11. Процесс осуществляют, как в примере 9. Отличие состоит в том, что долив стерильной воды начинают с четвертых суток. По результатам, представленным в табл. 2, видно, что при таком ведении процесса резко ухудшаются все показатели процесса как по сравнению с прототипом, так и в случаях когда долив стерильной воды начинают на

2-3 сут (см. табл. 2, пример 9 и 10) .

Таким образом, предложенный способ позволяет ферментировать мелассные среды повышенной концентрации, при этом съем лимонной кислоты с

1 м в сутки возрастал на 11,2Х.

Отсутствие щавелевой кислоты при ведении процесса по предлагаемой технологии исключает образование оксалата кальция при переработке сброженных растворов, вывоз оксалата кальция и связанные с этим транспортные расходы. Ведение процесса без доливов мелассных растворов уменьшает трудозатраты на стерилизацию подливных емкостей, приготовление подливных растворов мелассы и ведение дробных доливав за время ферментации. При этом уменьшается расход воды и пара. Исключение операции по доливу сред уменьшает возможность попадания посторонней микрофлоры, в результате чего улучшаются технико-экономические показатели.

Применение предлагаемой технологии на проектируемых заводах уменьшает капитальные затраты на оборудование бродильных цехов подливными емкостями и высвобождает производственные площади.

1221241 . ( х о

3 ж

1„

tf о

«

«6

0Е !

1!

1

1 л л о» л

1.0

E о

Ц и х A

«ч

1 сО

>х д о

СО Х

1 о

5ы о о ц х v

Х

1 >х о о х

Е» о

Я

1 о

Р

Е

ЕС Х о о« g

1 сч сч л и сч л л л ° « ° « ° «

О И 00 СЧ И О

СО О О

° о» л

00 ь л

С> ь со сi N о> - л-- rl

00 О С 1 СЧ 00 00 О СЧ

В СО И О с1 Ch O

И И

1 00

1 .Ch

1 сч

I !

I о х

g CI ц о е.» х сч л л О

«О - Ч:> СЧ Ch л л «« л л л

Оi СО t 00 O сч еч л

i» о с

1 >Х е о

I0 СС сб Э

И !

СО л

I I сч I 1 I 1

1 х о х >х х о х с ):1 - СО - СО 00 л ° I ° « л 4« л ° « л

О О О СЧ 00 О

Ch О\ О Ch О1 СО СО СО

00 л

Ch л о х х ес

>х

Й о >о о

Г.е

X л

Е» о

О О O О О О

И С> сЧ с

+> и < +! -н

О И О И И О

«О - О сЧ с

О СО СО

И И И » И И о

«ч

+I

С>

И

О О

О сч

+I +1 о о

00 Ch

И И

Ц

1 о

СЕ о

«О

Е»

v о х е и

Е

О л

Р cd и

Ю л

I

О О О О. И О О О л л л о л л л

И И И И И И о х

О

cd

Р

Е» е сс) v и е с

Э й

1 о

Р, л !

» И Е»

v X

cd Э х

О O O O O O O О

О О О О O О О О

О О О И VI О О О

Л О Л Л

3 х о е х х е сЕео ойй

Х F4 Э и е

Э

Р о

СС

«о и е

«0 и

Ql о! o

>Я

А

Е

1 х

Х I»

f» сб С4 о 8 е с«) " И О Л 00 I о э х

«

Р Р Р

И И и и

Э

СЕ о

Р х е х х

Э

Н о х

Е» о о

О х

Э

Э

«0

>о о и о х

С.) И

СЧ Ch СО Л Л Л Ch л л л л л л

СЧ О Л СЧ О

И О О О

1

I !

I

1 с> I

°вЂ”

«

Получено общей кислоты

Продолжительность

Время начала, Получено лимонной

Способ ведения процесса долив а воды, сут кислоты за цикл, кг за цикл, кг заключительных операций, сут

3200

2748

5,5

Прототип

Предлагаемый по примеру

3412

3014

5,4

Со 2

2858

5,2

3320

С 3 t0

2400

3000

5,0

С 4

Продолжение табл.2

Выхбд лимон ной

Расход 467-ной по сахару мелассы, кr

Способ ведения процесса на 1 т лимонной кислоты кислоты на цикл от сахара, 7

7716

Прототип

10,0

77,4

2808

Предлагаемый по примеру

2952

11,2

?3,6

8897

69,8

10,9

8897

3113

9,6

58,6

8897

3707

ВНИИПИ Заказ 1553/34 Тираж 490 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Съем лимонной кислоты мз в сутки, кг

1221241 14

Таблица 2 процесса, включая; ..

0,5 сут подготовительно