Способ определения активности сериновой протеазы

Способ определения активности сериновой протеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СоцИАЛИСТИЧЕСНИх

РЕСПУВЛИН

С 12 Q 1/38//G 01 N 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н flATEHTY в качес использ

R, где R, Ан

А„

Ф©

СО.

СИ

С0 (:Ь

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР по делАм изОБРетений и ОтнРытий (21) 3496751/28-14 (86) РСТ/SE/81/00235 (24.08.81) (22) 23.09.82 (31) 8005 940-5 (32) 25.08.80 (33).SE (46) 23.05 86. Бюл. Ф 19 (71) Кабивитрум АБ (ЯЕ) (72) Лайф Роджер Зимонссон, Зало

Ари Элли, Лайф Эрик Аурелл и Карл

Геран Клэсон (SE) (53) 547.583.5(088.8) (56) Патент СССР И1 736889, кл. G N 33/48, 1976. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ СЕРИНОВОИ ПРОТЕАЗЫ путем взаимодействия энзимсодержащего материала с маркированным веществом, содержащим производные аминокислот, .отличающийся тем, что, „SU „„1233806 А 3 тве маркированного вещества уют вещество общей формулы

-(А,(-(А,) -(A ) А -R,, — в одород, ацил; валин, иэолейцин, алании, глицин; — пролин, фенилаланин, глицин, валин, пипеколиновое производное глютаминовой кислоты, пироглютаминовая кислота, лейцин, алании, глютаминовая кислота, сложный метиловый эфир глютаминовой кислоты, аргинин, изолейцин, тирозин;

А — фенилаланин, пролин, лейцин, серин, глицин, валин, ала— нин;

А, — аргинин, лизин;

Р— люминол, иэолюминол;

n — 0 или 1.

-.,ЕЛОЧИ» Г РИВОДЯЩЕГО К ИЗМЕНЕНИВ р11 среды, Обеспечивающему:рекраще—

»»ИЕ,::;»Ы»»Ь|- ЕЙШЕЙ ак . HHHOC ТИ ПООТР»:.ЗЫ.

:- яркера -- -(вминола или изолвмино:та, : ределякт пу †:ем добавле -:ия окислиеля и иэмерення количества ricITóoêà—

"-могс при этсм света при помощи под::.одящего приспособления. Пои этом колвчество высвОбОждаюшеГО 6»аркера

«инейно пропорционально количеству знзимя., Озтому колич ес-»в О св ета . редс":. àâ!.:яет с Обой мер»у для активнос»; и протеазы. р и:: е г I: К раствору, содержащему 103 мкг: урокиназы и 200 мкл

, 0 - !1»»С» ., ° .G. I". - Гg — s?/ -HG E добав— лявт 800 мкл ем=-буфера с рН 9,0

»» ионной силой 0,05. Смесь инкубируют пои 37 С з †.е, чение 5 мин. Гидролиэ субстрата останавливают добавлением

237. ной уксусной кислоть»., отбирают

5 .3 мкл среды„ в котором спектрофлуорэметрнчегки определяют количество

»

-:--.-свабодивпегося маркера,иэолюминопа в3 ),,:.:;Оторое соответству т 0,01 единиць. ур ок ин а з ы .

Пример 2. К раствору согласно

",1»»:» !» имеру 1, сод яржащему Б качестве

»» фермен ra т ромбин, добавлявт в качестве субстрата =-ещества со структурой, приведенной в табл. I. Определяют

"инимальнсе ксличество фсрмента . I»»Kç ) = ко ОрОе вОзмОжнО выявить при

-;-хмощи использ;емых субстра.гав .

Рсзультаты сведены в табл, l.

Т : б л и и а I

Г И(- »,. м ол;-.

Энзим

ПриСубс рат мер

Трипсин Н-I3-Ча1-Ееп-Агg — Т з 7-2Н::1

6 25.10

pG1u-GIy Arg — 7э1-)- .С

6,5» 10

Вос-TI е GIu(NC,. Н ) -", Х: —, r g- i з i -H01

СЬО-Phe-Pro A g-1.»; ".

6.,25 10 и

2,5 10

Вос-Phe-Pro-Агр-Iÿ," БС

5,0 10

H-Phe-Pro-Arg--1: sf- 2HC t

2,5 10!

2 5 10

Bz--Arg Lum HC7

5,0,G

Изобретение относится к биохимии, в частности к способу определения активности сериновой протеазы.

Целью изобретения является:-.;овышение чувствительности способа., Способ осуществляют следующим ООразом.

В энэимсодержаший материал добавляют субстрат — маркированное вещсстВо, содержащее производные аминокис-лот, общей формулы

11, -(A, )л-(Aç „- ",)„-. . -1 1, где R, — водород, ацил;

A — валин, из ол ейцин, алан ин, 1 глицин

А — пролин, фенилаланин, глицил, валин, пипеколиновое произ-водное глютаминовой кислоты, пироглютаминовая кислота,, лейцин, алании, глютамино-вая кислота, сложный метил"вый эфир глютаминовой кислоты, аргинин, изолейцин, тирозин;

А — фенилаланин, пролин, лейцин, серин, глицин, валин алании;

А, — аргинин, лизин;

 — люминол, изолюминол; п - 0 или 1.

Реакцию взаимодействия протеаэы и субстрата проводят в условиях, обеспечивающих оптимальность проте-кания реакции для данного энзима.

В зависимости От степени активности протеазы и концентрации субстрата,, реакцию проводят в течение 0,5 — 5 мин прекращают,добавлением кис .Оты и ти

0я -.ем к Оличес тв а высв ободнвше Гo(. я

1233806

Продолжение табл,1

Bz-Arg-IsI HCI

СЬо-Phe-Arg-Isl HCY

Вос-С1у-Ргo-Lys Is 1 НС1

Вос-VaI-Len Lys-IsI НСТ

12

П р и м е ч а н и е : Вос — третичный бутилоксикарбонил, СЪо — карбобензокси, Bz — бензоил, pG Ги — пироглютаминовая кислота.

15 с применением сериновых ферментов и субстратов, согласно табл. 2.

Таблица 2

При

Фермент мер

Субстрат

1 Урокиназа pGhu-Ghy-Arg-IsI

0,01 единицы

pGhu-Ghy Arg-pNa

0,5 единицы

0 01,10 3 единицы

3,5 IO единицы

Н-П-Phe-pip-Arg-pNa

0,02 10 единицы казеина

1 "10 единицы казеина

Н-0 Va1 — Leu-Lys-pNa

Н-.Э вЂ” Ча1 — Len-Arg-Is I -2НС 7;

СЬо-GI у-Pro Arg-IsР.HC?;

Вос-IIe-Gtu(NC, Нд ) -CIy Arg — IsI HC?;

Н-Р? е-Pro-Arg-IsI;

Bz-Arg-Lum HCI;

Bz-Arg-IsI HCI;

Н-0-Leu-Ser Àrg — Is 1 - -2НСХ;

СЬо-CIy-GIy-Arg-Lum АсОН;

Ас-AIa-Pro-Arg-Is Т;

Suc — Ala-Pro-Lys-Is Т;

Н-0-Arg UaI-Tyr-Is I-2HCI .

Количество высвободившегося маркера соответствует используемой в опыте концентрации фермента.

ВНИИПИ Заказ 2789/60 Тираж 490

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул . Проектная, 4

Пример 3. Повторяют осуществление способа, согласно примеру 1, 3 Тромбин Tos-Phe-Pro-Arg-I.зТ

5 Плазмин Вос-Va1-Leu — Lys — Is I

Представленные данные показывают, что использование изобретения (приме- 40 меры 1, 3, и 5) позволяет повысить чувствительность способа определе— ния активности сериновых протеаз в сравнении с известным способом (примеры 2, 4 и 6). 45

Пример 4. Повторяют осуществления способа, согласно примеру 1, в качестве фермента используют

-15

5,0"10 М трипсина, а в качестве S0 субстратов используют нижеперечис— ленные:

5,0 !О

12,5 10-"

IB,0 10-" 2,5 10