Способ получения антибиотика и штамм @ @ -продуцент антибиотика ввм-1644

Способ получения антибиотика и штамм @ @ -продуцент антибиотика ввм-1644

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. Способ получения антибиотика, заключающийся в том, что штамм Acti ir.t.V. nomadura sp. АТСС 39144 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в глубинных аэробных условиях с последующим отделением биомассы,выделением целевого продукта из жидкой фазы и его очисткой . 2. Штамм Actinomadura sp., АТСС 39144 (American Type Culture Collection ) - продуцент антибиотика ВВМ- 1644. N9 4ib СО СО ы

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЩИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и.. Н ПАТЕНТУ

v i к.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) - 3635252/28-14 (22) 22.08.83 (46) 30.06.86. Бюл. Р 24 (71) Бристоль-Мейерз Компани .(П8) (72) Масатаха Кониси, Фумихиде Сакаи, Такео Мияки и Хироси Кавагути (JP) (53) 615. 779. 93 (088. 8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

И ШТАК1 ACTINOMADURA БР. — ПРОДУЦЕНТ

АНТИБИОТИКА BBM-1644. (57) 1. Способ получения антибиотика, заключающийся в том, что штамм ActiÄSU ÄÄ 1241997 А 3 (59 4 С 12 Р 1/06 // (С 12 P 1/06, С 12 R 1:03) nomadura sp. АТСС 39144 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в глубинных аэробных условиях с последующим отделением биомассы, выделением целевого продукта из жидкой фазы и его очисткой.

2. Штамм Actinomadura sp., АТСС

39144 (American Туре Culture Соllесtion) — продуцент антибиотика ВВМ1644.

1241997 2

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотика.

Целью изобретения является разработка способа получения нового полипептидного антибиотика, обладающего противоопухолевой активностью, Целью изобретения также является изыскание штамма, способного продуцировать этот антибиотик. Штамм Actinomadura зр. Н710-49 выделен из почвенного образца, Депонирован в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 39144 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Штамм образует как субстратный, так и воздушный мицелий. Субстратный мицелий длинный и разветвленный и не фрагментируется на короткие цепочки нити ° Короткие споровые цепочки зарождаются на верхушке или моноподиальном ответвлении воздушного мицелия. Споровые цепочки содержат

2-15 спор на цепь (4-8 спор) и могут быть прямыми или иметь форму крючка или петли. Споры имеют бородавчатую поверхность и овальную или эллиптическую форму 0,5- 0,0.у 0,!в !,2 мкм) с круглым или эеостреииым концом. Зрелые споры часто отделяются друг от друга полыми гифами.

Иногда наблюдаются терминальные наплывы гифы на субстратном мицелии, по. мещенном на агар Чапека и агар Беннета.

Триптон-дрожжевой экстракт-бульон.

Рост хлопьевидноопущенный, седиментированный и не пигментированHbIH

Агар Чапека .. Рост скудный. Окраска от бесцветного до бледооранжевого (73)(Цветной стандарт из книги

К.Л.Келли и Д.Б.Джудд. ISCC-NBC color-паше charts illustrated with

centroid colors, U,S. De t of Comm.

cire„ 553, Вашингтон, D;C., 1975 г.).

Воздушный мицелий скудей, опалый

{263), пигмент отсутствует.

Глюкоэоаспарагиновый агар. Рост плохой. Окраска от желтовато-желтого (92) до темного оранжевого-желтоватого (69). Воздушный мицелий очень скудный, белый (263), пигмент отсутствует.

Глицерин-аспарагиновый агар. Рост от плохого до умеренного. Окраска от слабо-желтого (89) до темного оранжевато-желтого (72). Воздушный мицелий слабораэвитый, белый (263) до слабого желтовато-розового (31). Пигмент бриллиантово-желтый (83) .

Крахмальный агар с минеральными салями. Рост от слабого до умеренно10 ro. Окраска от бесцветного до глубо- кого желтого (85). Воздушный мицелий е слаборазвитыйр от розовато-белого до слабо-желтовато-розового (31), пигмент отсутствует.

1.1 Тироэиновый агар. Рост умеренный.

Окраска от коричневато-оранжевого до умеренного красновато-корич- невого (43). Воздушный мицелий слабораэвитьп, от белого до светло-желтого.

2б (89)е Пигмент сильный, желтый (84).

Агар с дрожжевым экстрактом и экстрактом солода. Рост умеренный. Окраска от темно-желтого (88) до темнокоричйевого (59), воздушный мицелий

2. у скудный белый (2631. пигмент свет-, лый,оливково-коричневый (94), Агар Беннета. Рост умеренный, ок раска îI серовато-желтовато-коричневого (180) до темного серовато-коgI) ричневого (62),воздушный мицелий очень скудный, белый (263), пигмент умеренный оливково-коричневый (95) .

Физиолого-биохимические признаки.

Максимальный рост на arape Беннета при 28 С. Умеренный рост при 20

35 и 37оС. Отсутствие роста при 10 и

41 С„ Желатин разжижает. Крахмал гидролиэует. Снятое молоко пептонизируету не коагулирует. Меланоиды не вырабатывает. Нитраты в нитриты восстанавливает.

Умеренно устойчив к NaC1 — рост при концентрации 7Х, отсутствие роста при концентрации 10Х. Устойчив к лиэоциму, рост при 0,001Х. Оптимум

4 рН 6,0, при рН 5,0 рост отсутствует.

Усваивает глицерин, (+) арабиноэу, б-ксилозу; 3-рибозу> L-рамнозу, L-глюкозуу L-фруктозу, целлобиозу, трегалозу, растворимый крахмал, D-маннит.

Не усваивает D(-)-арабинозу, L-га.лактозу, L-маннозу, 1(-)-сорбозу, сахарозу, лактоэу, мелиоидозу, раффиноэу D(+)-мелеэитозу, целлюлозу, 5cj ,цульцит, инозит, D-сорбит, салицин.

Способ с использованием штамма

АТСС 39144 иллюстрируется следующими примерами.

1241

Пример 1. Ферментация.

Готовят посевную среду, содержащую,. Ж: маннит 1, пентон 2 и дрожжевой экстракт 1; рН 7,2 (до стерилизации). 100 мл среды в 500 мл колбе

Эрленмейера инокулируют культурой, инкубируют при 32 С в течение 72 ч на роторной качалке (250 об/мин). Затем 5 мл культуры переносят во вторую посевную среду (100 мл) того же состава и культивируют в тех же условиях.

5 мл посевного материала вносят в 100 мл ферментационной среды, содержащей, Е; маннит 2,5; глюкоза 0,5; 5 соевый порошок 1, пептон 0,5, мясной экстракт 1, СаСО 0,3 и NaC1 0,2, помещенной 500-мл колбу Эрленмейера.

Ферментацию проводят при 28 С о в роторном смесителе при скорости вращения 250 об/мин.

Антибиотическая активность достигает 300 мкг/мл через 6-7 дн.

Пример 2. Выделение, 18 л культуральной жидкости, полу- 25 ченной по примеру 1, центрифугируют, полученную жидкую фазу концентриру-. ют при температуре ниже 40оС до 1/10 начального объема. Концентрат анали— зируют с помощью целлофановой трубки против водопроводной воды в холод— ном помещении. Диализат концентрируют до объема 1,5 л и центрифугируют (8000 g) для удаления нерастворимых веществ. Прозрачный верхний слой на35 сыщают сульфатом аммония и выдержио вают .в течение 5 ч при 5 С. Полученный осадок отделяют центрифугированием, растворяют его a.

300 мл воды и обессоливают путем

40 диализа против водопроводной воды.

700 мл диализата содержит 22 r неочищенного твердогО антибиотика. Раствор антибиотика пропускают через колонку с ДЕАŠ†целлюлоз (CI, 400 мл), 45 колонку промывают 1 л воды и проявляют 1/15 M фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 0,3 M NaC1. Активные фракI .ции объединяют (300 мл), диализуют в течение 18 ч против водопроводной

50 воды и хроматографируют на колонке с ДЕАŠ— целлюлозой (400 мл), которую уравновешивают 1/14 М раствором фосфатного буфера рН 7,5. Эту колонку проявляют тем же буфером, содержащим

55 градиентную концентрацию NaC1 (О0,2 М). Активный элюат (17 мл) обессоливают путем диализа и загружают в колонку с ДЕАЕ-сефадексом А-50.

997 4

Колонку проявляют 1/15 M раствора буфера фосфатного, рН 7,5, содержащим градиентную концентрацию NaC1 (0 — .

0,3 M). Активные фракции объединяют и диализуют против воды в течение

18 ч. Обессоленный раствор (18 мл) .хроматографируют на колонке с ДЕАЕсефадексом А50 с использованием

1/15 М раствора фосфатного буфера рН 7,0 с содержанием NaC1 от 0 до

0,3 M в качестве элюента.

Соответствующие фракции собирают, концентрируют до объема 10 мл и обессоливают на колонке с сефадексом

С-50. Колонку элюируют деионизированной водой и активный элюат лиофилизируют. Получают 120 мг белого аморфного порошка.

При исследовании методом бумажного электрофореза высокого напряжения (4500 В. в 0,05 M барбиталовом буфере при рН 8,6) антибиотик

ВВМ-1644 мигрирует в виде кислоты, передвигающейся на 8,7 см через 1 ч в направлении анода.

Антибиотик не имеет определенной точки плавления и постепенно разлага- ется при температуре выше 240 С. Растворим в воде, практически нерастворим в обычных органических растворителях.

26

Оптическое-вращение: с (а) П о

= -75,6 в 0,25Х-ном водном растворе.

УФ-спектр имеет адсорбционный максимум при 275 нм (Е4 „ 8,2) и 310 нм (Е „„ 4,6, плечо) в водном раствоare ре. В 0,01 N растворе НСI УФ-спектр практически идентичен УФ-спектру в воде, в 0,01 N растворе NaOFI имеет лишь один максимум при 285 нм (Е,,„.

44

8,9) . ИК-спектр, снятый в KBr, указывает на наличие NH-и ОН-групп (3302С180 см ) и амидных групп (1650 и

1540 см 1)

Дает положительные реакции на реагент Фолин-Лоури, ксантопротеин, биурет и нингидрин, обесцвечивает раствор перманганата калия.

Дает отрицательные реакции с антроном и реактивом Сакагуши.

Молекулярный вес примерно 22000.

Элементный состав, Ж: С 46,6; H

6,45; N 13,43; S 0,2.

Имеется 13 видов аминокислот: аланин, аспарагиновая кислота, глицин, полу-цистеин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, фенилаланин, пролин серин, треонин, тирозин, валин.

Антибиотик довольно устойчив в интервале значений рН от 2 до 9. Вод".

Антибиотик. может применяться в комбинации с инертными носителями в любой фармацевтической форме, упо-, требляемой для парентерального применения.

Составитель Г. Смирнова

Техред И.Попович Корректор Т.Колб

Редактор Ю.Середа

Заказ Зб19/60 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

$ 1241997 б ный раствор устойчив в течение 2 ч ные дозировки антибиотика вводят мы— при 50 С при нейтральном значении. шам внутрибрюшинно через 24 ч посрН. После экспонирования на УФ све- ле имплантаЦии опухоли. Применение те антибиотическая активность теря- препарата осуществляют 1 раэ в день ется эа 20 мин. 5 на 1, 4 и 7- сут (тройная доза через

Способен индуцировать профаг в день| или последовательно в течение лизогенных бактериях. 9 дн I I доза ежедневно) . Наибольшей

Проявляет антимикробную актив- активностью против лейкемии мышей ность по отношению к грамположи- обладает препарат в дозе 0,03тельным и кислотоустойчивым бакте- 16 1,0 мг/кг/день. риям.

Противоопухолевую активность проверяют на мышах линии BDFq против лимфоцитной лейкемии Р388. Каждому животному инокулируют внутрибрюшинно 3 ° 10 клеток опухоли. Определен—