Способ определения сфингомиелина

Способ определения сфингомиелина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к способу определения сфингомиелина. Цель изобретения - упрощение способа за. счет титрования сфингомиелина белками-гемолизинами морских анемон. К исследуемому материалу добавляют белкигемолизины из морских анемон. Добавляют эритроциты. Определяют точку эквивалентности по появлению гемолиза эритроцитов. Исходя из молекулярной массы используемого гемолизина, его концентрации, объема раствора гемолизина и объема пробы, рассчитывают содержания сфингомиелина. 3 табл. с (О O 00 N9

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕЛ

К А BTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3808934/28-14 (22) 08. 10. 84 (46) 07.07.86. Бюл. Ф 25 (71) Тихоокеанский. институт биоорганической химии Дальневосточного научного центра АН СССР (72) М.М.Монастырная, 3.П.Козловская, А.С.Иванов, А.А.Мольнар и Г.Б.Еляков (53) 547.953 (088.8) (56) Enzymatic Phospholipid

Analysis. Boehringer Mannheim GmbH

Biochemica. 1983, 21. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СФИНГОМИЕЛИНА

„, SU,» 1242826 А 1 (50 4 (01 И 33/48, 33/50, 33/68 (57) Изобретение относится к способу определения сфингомиелина. Цель изобретения — упрощение способа за. счет титрования сфингомиелина белками-гемолизинами морских анемон. К исследуемому материалу добавляют белкигемолизины из морских анемон. Добавляют эритроциты. Определяют точку эквивалентности по появлению гемолиза эритроцитов. Исходя из молекулярной массы используемого гемолизина, его концентрации, объема раствора гемолизина и объема пробы, рассчитывают содержания сфингомиелина. 3 табл.

1 !242

Изобретение относится к биологии, биотехнологии и медицине, в частности к, способам быстрого определения сфингомиелина в органах и тканях, в биологических продуктах и биологических жидкостях организма.

Цель изобретения — упрощение способа за счет титрования сфингомиелина белками-гемолизинами морских анемон и последующего определения точ— ки эквивалентности по гемолизу эритроцитов.

Способ осуществляется следующим образом, К материалу, содержащему сфингомиелин, добавляняг белки-гемолизины из морских анемон, затем вносят эритроциты и определяют точку эквивалентности по появлению гемолиза эритроциП P и м е р 1. В серии пробирок делают ряд разведений пробы (сыворотки крови человека), добавляют гемо10 лизин РТХ из морской актинии

Radianthus macrodactylus (20 мкл, ucf 1 ходная концентрация 100 мкг/мл), смесь инкубируют 30 мин при комнат( ной температуре, затем во все про15 бирки добавляют по 1 мл IУ.-ной суспензии эритроцитов. Количественные соотношения сфингомиелина и гемолизина, а также последовательность операций приведены в табл.1.

Таблица 1

Показатели и компоненты

I, Проба сыворотки, разведен-, ная в 100 раз, мкл

6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12 0 13,0 14 0 1S,0

Физиологический раствор, мкл 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0

Гемолизин РТХ, мкм

20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

Инкубация 30 мин

17-ная суспензия эрытроцитов, мл 1,0 1,0 1,0 1,0 l,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Инкубация 5 мин

Гемолиэ

10з

С С у, h где С „ — концентрация сфингомиелина в пробе, моль/л;

Из табл.t видно, что точка эквивалентности наблюдается в пятой про-. бирке. В предыдущих четырех пробирках концентрация гемолизина избыточна для связывания со сфингомиелином пробы и наблюдается гемолиз тестовых эритроцитов. В пробирках 6-10 количества гемолизина недостаточно для связывания со сфингомиелином, что подтверждается отсутствием гемолиза тестовых эритроцитов.

826 2 тов. Исходя из молекулярного веса используемого гемолизина, его концентрации, объема раствора гемолизина и объема пробы, рассчитывают содержание сфингомиелина.

Количество сфингомиелина в пробе расчитывается исходя из молекулярно50 ro веса гемолизина PTX (16 000 ед.) и необходимого для взаимодействия соотношения гемолизин-сфингомиелин (1.:1) в молях по формуле

1242826

Ячейка планшета

2 3 4 5 6

Показатели и компоненты

1! 7 J 8

Результаты титрования (гемолиэ тестовых эритроцитов) +/- + + + + + +. +/- +

+/- + + +

+/- . + + +

+/- + +

+/- +

+/- +

Сыворотка, разведенная в 100 раз, мкл

5 6 8 10 11 13 15

Гемолизин (50 мкг/мл), мкл

6 8 концентрация раствора гемолизина РТХ, г/л; — объем раствора гемолизина

РТХ, л; — молекулярный вес гемолизин а РТХ; — объем пробы, л.

Поскольку точка эквивалентности наблюдается в пятой пробирке то С=

=10 г/л; V =2 10 л; VÄ=10 л и

С Ä =0,0125 ммоль/л.

Так. как сыворотка разведена в 100 раз, концентрация сфингомиелина в ней составляет 0,0125 ° 10 =1,25 моль/л.

Если молекулярный вес сфингомиелина

Из табл.2 видно, что точка экви- 55 валентности наблюдается во всех случаях при одном и том же соотношении специфически реагирующих компонен600, то его концентрация 1,25 ° 600:=

=, 75 мг/100 мл.

Пример 2. В ячейки планшета однократного применения (для про5 ведения серийного анализа сфингомиелина титрование можно вести в ячейках стандартного планшета для иммунологических реакций) раскапывают се-, рию проб одной.и той же разведенной .в 100 раз сыворотки крови человека, добавляют гемолизин РТХ (исходная, концентрация 50 мкг/мп), инкубируют

30 мин при комнатной температуре.

Затем во все ячейки добавляют 1Х-ную 5 суспензию эритроцитов. Соотношение компонентов и результаты титрования приведены в табл.2.

Таблица 2

10 12 14 16 18 тов. Концентрация сфингомиелина см, определенная по формуле (t), составляет для первой ячейки 4, 1, для второй 3,8, третьей, 4, 1, четвертой

1242826

Т а б л и ц а 3

Пробирка

Показатели и компоненты

2 (4 5

Проба сыворотки, разведенная в 100 раз, мкл 6Ä0

8,0 10 0 12,0 14,0

7,0 5,0 3,0 1,0

Физиологический раствор, мкл 9,0

Гемолизин из актинии

S.helianthus, мкл

20,0 20,0 20,0 20,0

20,0

Инкубация гемолизина со сфингомелином 30 мин

1Х-ная суспензия эритроцитов мл

101,0101,О1,О

Инкубация 5 мин

Гемолиз

Составитель H,Гуляева

ТехРед О..;опко Корректор B,сутяга

Редактор А.Шишкина

Заказ 3697/42

Тираж 778 Подписное

BHKIIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4

4,0, пятой 3,8, шестой 3,9 и седьмой

3,8 мкмоль/л. Средняя концентрация сфингомиелина С =3,92+0,13 мкмоль/л ср

Пример 3. B серию пробирок . с разведенной пробой (,проба сыворотки человека та же, что и в примере

1) добавляют гемолизин из актинии

Количество сфингомиелина в пробе рассчитывается исходя из молекулярной массы гемолизина из актинии

S hsl1Gnthus 16000 и эквимолярного взаимодействия гемолизина с.о сфинго-миелином по формуле (1).

Поскольку точка эквивалентности 4п наблюдается в третьей пробирке, то

Vг 2 10 л; Vï 10 л и C =10 г/л и С = О 0125 ммоль/л. Так как сысм воротка разведена в 100 раз и концентрация сфингомиелина равна 600, то

Ссм = 0.,0125 100"600 = 75 мг/10 мл,. что соответствует концентрации сфинStoi"..hact is hei ianthus (20 мкл, исходная концентрация 100 мкг/мл), смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре, а затем во все пробирки добавляют по 1 мл 1/-ной сус-. пензии эритроцитов. Результаты приведены в табл.3. гомиелина, определенной с помощью гемолизина РТХ:

Формула изобретения

Способ определения сфингомиелина путем проведения специфической реакции "o сфингомиелином пробы биологического материала, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощения способа, сфингомиелин титруют белками-гомолизинами морских анемон, затем дсбавляют эритроциты, определяют точку эквивалентности по появлению гемолиза эритроцитов и рассчитывают содержание сфингомиелина.