Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие синтез производных соматотропного гормона человека, способ их конструирования, штаммы escherichia coli, содержащие эти плазмиды - продуценты производных соматотропного гормона человека (их варианты)

Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие синтез производных соматотропного гормона человека, способ их конструирования, штаммы escherichia coli, содержащие эти плазмиды - продуценты производных соматотропного гормона человека (их варианты)

Реферат

 

(19)RU(11)1248280(13)C(51)  МПК ⁶    _C12N15/18Статус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина: учтена за 20 год с 09.07.2002 по 08.07.2003

(54) РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПЛАЗМИДНЫЕ ДНК, КОДИРУЮЩИЕ СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ИХ КОНСТРУИРОВАНИЯ, ШТАММЫ ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИЕ ЭТИ ПЛАЗМИДЫ - ПРОДУЦЕНТЫ ПРОИЗВОДНЫХ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА (ИХ ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии и представляют собой рекомбинантные плазмидные ДНК, обуславливающие синтез производных соматотропного гормона человека (СТГЧ), способ конструирования данных рекомбинантных плазмидных ДНК и штаммы - продуценты производных СТГЧ, содержащие эти рекомбинантные плазмиды. СТГЧ синтезируется в аденогипофизе в виде прогормона, содержащего на N-конце дополнительную последовательность из 26 аминокислотных звеньев, так называемую "лидерную" или "сигнальную" последовательность, которая удаляется в ходе процессинга, сопряженного с секрецией гормона. Использование методов генетической инженерии позволяет решить задачу получения полипептидных гормонов человека принципиально новым путем. С этой целью возможно выделение или синтез гена гормона и введение его в бактериальную клетку, например, в составе бактериальной плазмиды, обеспечивающей нормальную репликацию данного гена и его экспрессию и в результате - биосинтез гормона человека в бактериальной клетке. Такой подход применим для получения штаммов бактерий продуцентов СТГ человека или его производных. Известны рекомбинантные ДНК, кодирующие синтез некоторых производных СТГЧ. 1. Описанная в работе (Goeddel D.V. et al. Nature, 1979, 281, 544-548) плазмида включает ДНК векторной плазмиды рВR 322, фрагмент кДНК СТГЧ размером в 551 нуклеотидную пару, химически синтезированный фрагмент ДНК, кодирующий 24 N-концевые аминокислоты СТГЧ и дополнительный АТG - инициирующий кодон и фрагмент ДНК в 285 нуклеотидных пар, содержащий 2 тандемно расположенных UV-5 lac-промотора. Описанная рекомбинантная плазмида обеспечивает биосинтез в клетках E.coli штамма 1776 2,4 мг/л культуры производного СТГЧ, содержащего на N-конце дополнительный остаток метионина, при плотности культуры 3,6х10⁸ клеток на 1 мл. Рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие синтез других производных СТГЧ, в литературе не описаны. Использование методов генетической инженерии позволяет получать различные производные необходимых для медицины и сельского хозяйства полипептидов, отличающихся, в частности, наличием на концах молекулы дополнительных аминокислотных звеньев или, наоборот, лишенных части аминокислотных остатков. Полученные производные могут обладать ценными свойствами, такими как большая устойчивость к протеазам, стабильность, более высокая специфичность или избирательность действия. Они могут использоваться также как модели для изучения роли различных структурных элементов полипептидов для их функционирования. 11. Известный способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез мет -СТГЧ, описанный в работе Goeddel D.V. et al. Nature, 1979, 281, 544-548, состоит в том, что фрагмент кДНК СТГЧ размером 551 нуклеотидная пара, кодирующий аминокислотные остатки 24-191 СТГЧ, полученный путем расщепления клонированной кДНК эндонуклеазой рестриктации Нае III, вводят в Pst I-сайт векторной плазмиды рВR 322 через олиго-dС-олиго-dG-адаптопы (при этом восстанавливая Нае III участки расщепления), получая плазмиду pHGH 31. Отдельно синтезируют олигонуклеотиды, путем сшивания которых получают фрагмент ДНК, кодирующий 24 N-концевых аминокислотных остатков СТГЧ и дополнительный АТG-кодон и имеющий 5'-выступающие липкие концы, соответствующие участкам расщепления рестриктаз ЕсоRI и Hind III. Данный фрагмент встраивают в векторную плазмиду pВR 322, получая рекомбинантную плазмиду рНGH 3. Далее фрагмент EcoRI-Hae III, выделенный из плазмидной ДНК рНGH 3, сшивают с фрагментом Нае III-Xma I, выделенным из плазмидной ДНК рНGH 31, и встраивают полученный полноразмерный квазисинтетический ген СТГЧ в плазмиду, содержащую два тандемно расположенных lac VU-5-промотора, сконструированную на основе вектора рВR 322, получая плазмидную ДНК рНGH 107, а затем путем удаления из участка расщепления рестриктазы ЕсоRI четырех нуклеотидных пар плазмидную ДНК рНGH 107-1. Описанный способ позволяет получить плазмидные ДНК, обеспечивающие прямую экспрессию Мет-СТГЧ. Недостатком метода является необходимость в химическом синтезе набора синтетических олигонуклеотидов (12 олигонуклеотидов размером 12-14 остатков), что является весьма трудоемкой задачей. Использование этого способа позволяет получить только один тип рекомбинантных плазмидных ДНК, обеспечивающих синтез производного СТГЧ. Для получения других плазмид необходимо использовать иные по структуре олигонуклеотиды, что еще более усложняет данную методику. Кроме того, уровень экспрессии Мет-СТГЧ, обеспечиваемый плазмидой, сконструированной описанным методом, является недостаточно высоким. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающий синтез других производных СТГЧ под контролем lac UV-5 или других промоторов в литературе не описан. Известны следующие штаммы-продуценты Мет-СТГЧ: штамм Е.coli 1776, несущий плазмиду рНGH 107, обеспечивающий выход 2,4 мг Мет-СТГЧ на 1 л культуры при плотности 3,6х10⁸ клеток на 1 мл; штамм Е. coli 1176, несущий плазмиду рНGH 107-1, обеспечивающий выход 1,4 мг Мет-СТГЧ на литр культуры при той же плотности; штамм Е.сoli D1210, несущий плазмиду рНGH 107, обеспечивающий выход 1,0 мг Мет-СТГЧ на 1 л культуры при плотности 3,8x10⁸ клеток на 1 мл после индукции синтеза с помощью ИПТГ. Целью предлагаемых объектов изобретения является создание штаммов Е. coli, содержащих рекомбинантные плазмиды ДНК, обеспечивающие синтез различных производных СТГЧ с высоким выходом целевых продуктов. Поставленная цель достигается тем, что сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/р, обеспечивающие синтез различных производных СТГЧ в клетках бактерий и обозначенные авторами рSTH/P-lac, pSTH/P-tac, pSTH/P-trp. В способе конструирования данных плазмидных ДНК для достижения поставленных целей в плазмидную ДНК рBR 322 вносят сначала последовательность кДНК, синтезированной на матрице мРНК из аденомы гипофиза человека, известными методами отбирают плазмидную ДНК, содержащую полноразмерную копию кДНК СТГЧ и обеспеченную р-pre STH, далее путем нуклеазной обработки плазмидной ДНК р-pre STH получают набор плазмидных ДНК, содержащих укороченный ген СТГЧ, встраивают перед началом кодирующей части этого гена инициирующий кодон и затем вводят перед ним фрагмент ДНК, содержащий бактериальный промотор, например двойной lac UV-5-промотор или trp-промотор, или гибридный tac-промотор, получая серии плазмид, обозначенных рSTH/P-lac, pSTH/P-trp и pSTH/P-tac соответственно. Рекомбинантные плазмидные ДНК разных серий обеспечивают в штаммах E. coli синтез производных СТГЧ с различным выходом (далее приведены экспериментальные данные для штамма E.coli К 802). Промоторы, используемые в предлагаемых плазмидных ДНК, являются регулируемыми. Использование индукторов, таких как ИПТГ в случае lac- и tac-промоторов или -индолилуксусной кислоты в случае trp-промотора позволяют увеличить синтез продуктов в определенных штаммах Е.coli. Для достижения поставленных целей предлагаются также штаммы Е. coli K 802, содержащие одну из рекомбинантных плазмид, сконструированных описанным способом. А. Сущность рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-lac (pSTH 38+4/P-lac, pSTH 33+3/P-lac, pSTH 35-0/P-lac, pSTH 19-1/P-lac, pSTH 9-2/P-lac, pSTH 12-4/P-lac, pSTH 14-10/P-lac) состоит в том, что они содержат репликон плазмиды рBR 322, фрагмент содержащий двойной lac-UV-5-промотор и фрагмент клонированной кДНК СТГЧ, содержащий укороченный вариант гена СТГЧ, а именно состоят из следующих элементов: плазмидная ДНК вектора рBR 322 за исключением участка размером 35 п.о. между участками расщепления рестриктаз EcoRI и Hind III, размер которой 4331 п.о.; EcoRI - фрагмент, содержащий двойной lac UV-5-промотор, размером 285 п. о. ЕcoRI-Hind III-фрагмент, содержащий укороченный ген СТГЧ, перед которым встроена последовательность ААТТС ТАТG, первые 5 нуклеотидов которой являются частью участка расщепления ЕсоRI, а последние 3 нуклеотида представляют собой инициирующий кодон АТG, за которым в индивидуальных плазмидах данной серии следуют последовательности, представленные ниже pSTH 38+4/P-lac - G C T C TC ... pSTH 33+3/P-lac - C T C TC CA ... pSTH 35-O/P-lac - TC CA AC AT CC ... pSTH 19-1/P-lac - CA AC AT CC TA ... pSTH 9-2/P-lac - AC AT CC TA TC ... pSTH 12-4/P-lac - CC TA TC AG CT ... pSTH 14-10/P-lac - C C T G C ... В приведенных нуклеотидных последовательностях инициирующий АТG-кодон подчеркнут, цифры над триплетами обозначают номера сохранившихся кодонов сигнального пептида прегормона (со знаком + ) или кодонов зрелого гормона. Молекулярная масса гибридных плазмид серии рSTH/P-lac равна 3,4 мд, размер 5300 п.о. Копийность полученных плазмид около 20-30 молекул на клетку. Плазмидные ДНК серии рSTH/P-lac содержат уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз ЕсoRY, BamHI. Hind III, SalGI и Bgl II, по два сайта рестрикции для ферментов EcoRI и Pst I. Это было установлено путем расщепления гибридных плазмидных ДНК эндонуклеазами рестрикции и анализа продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле (см.табл.1). В состав рекомбинантных плазмидных ДНК серии pSTH/P-lac входят гены: SТH - модифицированный ген СТГЧ, обеспечивающий синтез следующих производных этого гормона в случае индивидуальных плазмид данной серии: pSTH 38 + 4/P-lac - Мет-Глу-Гли-Сер-Ала-СТГЧ; pSTH 33 + 3/Р-lаc - Мет- Гли-Сер-Ала-СТГЧ; pSTH 35-0/Р-lаc - Мет-СТГЧ; pSTH 19-1/Р-lаc - Мет-(дез-фен¹)-СТГЧ; pSTH 9-2/Р-lаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ; pSTH 12-4/Р-lаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ; pSTH 14-10/Р-lаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷ -Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-СТГЧ. bla - ген, обеспечивающий синтез -лактамазы; tet - ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотику тетрациклину штаммов, несущих плазмиды. Репликация рекомбинантных плазмидных ДНК осуществляется за счет репликона плазмиды рBR 322. Синтез производных СТГЧ осуществляется под контролем lac UV-5-промотора. Ген tet, расположенный дистально по отношению к последовательности, кодирующей производное СТГЧ, также экспрессируется под контролем этого промотора, но с меньшей интенсивностью, чем в исходной плазмиде рBR 322, что обеспечивает устойчивость штаммов, несущих плазмиду серии рSТН/P-lac к пониженной концентрации тетрациклина (20 мг/л на твердой питательной среде, 5-7 мл/л в жидкой питательной среде). Рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-lac амплифицируются при добавлении в среду хлорамфеникола, неконъюгативны. Б. Сущность рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-tac (pSTH 35-0/P-tac, pSTH 19-1/P-tac, pSTH 9-2/P-tac, pSTH 12-4/P-tac, pSTH 14-10/P-tac) состоит в том, что они содержат репликон плазмиды рBR 322; фрагмент, содержащий гибридный tac-промотор, и фрагмент клонированной кДНК СТГЧ, содержащий укороченный вариант гена СТГЧ, а именно состоят из следующих элементов: плазмидная ДНК вектора рBR 322 размером 4331 п.о.; ЕсоRI - фрагмент, содержащий гибридный tac-промотор, размером 276 п.о.; ЕcoRI-Hind III - фрагмент, содержащий укороченный ген СТГЧ, перед которым встроена последовательность ААТТСТТАТG, первые 5 нуклеотидов которой являются частью сайта расщепления ЕсоRI, а последние 3 нуклеотида представляют собой инициирующий кодон ATG, за которым в индивидуальных плазмидных ДНК данной серии следуют последовательности, представленные ниже: pSTH 35-O/P-tac - TC CA AC AT CC ... pSTH 19-1/0-tac - CA AC AT CC TA ... pSTH 9-2/P-tac - AC AT CC TA TC ... pSTH 12-4/P-tac - CC TA TC AG CT ... pSTH 14-10/P-tac - C C T G C ... В приведенных нуклеотидных последовательностях инициирующий АТG-кодон подчеркнут, цифры над триплетами обозначают номера кодонов зрелого СТГЧ. Молекулярная масса гибридных плазмидных ДНК серии рSTH/P-tac равна 3,4 мд, размер 5300 п.р. ДНК плазмид серии рSTH/P-tac содержит уникальные сайты рестрикции EcoRY, BamHI, Hind III, SalGI, Bgl II и по два сайта рестрикции ЕсоRI и Pst I, что установлено путем расщепления плазмидных ДНК эндонуклеазами рестрикции и анализа продуктов расщепления с помощью электрофореза в агарозном геле (см.табл.2). Из сравнения данных табл.1 и 2 видно, что продукты расщепления плазмидных ДНК рSTH/P-lac и pSTH/P-tac рестриктазами Hind III, BamHI, EcoRV, Bgl II и Pst I неотличимы по подвижности в агаровых гелях. При расщеплении плазмидных ДНК рестриктазой ЕсоRI образуются два фрагмента размером 5000 п. о. и 285 п.о. в случае рSTH/P-lac и 5000 п.о. и 275 п.о. в случае рSTH/P-tac. Из электрофореграммы 8% -ного акриламидного геля видно различие в подвижности меньших фрагментов ЕсоRI-гидролизатов плазмид серий pSTH/P-lac и pSTH/P-tac. В состав рекомбинантных плазмидных ДНК серии pSTH/P-tac входят гены: STH - модифицированный ген СТГЧ, обеспечивающий синтез следующих производных этого гормона в случае индивидуальных плазмид данной серии: pSTH 35-0/Р-tаc - Мет-СТГЧ pSTH 19-1/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ pSTH 9-2/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ pSTH 12-4/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ pSTH 14-10/Р-tаc - Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷ -Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)-СТГЧ bla - ген, обеспечивающий синтез -лактамазы; tet - ген, обеспечивающий устойчивость штаммов, несущих плазмиды, к тетрациклину. Репликация рекомбинантных плазмид осуществляется за счет репликона рBR 322. Синтез производных СТГЧ осуществляется под контролем tac-промотора. Ген tet, расположенный дистально по отношению к последовательности, кодирующей производное СТГЧ, также экспрессируется под контролем tac-промотора, но с меньшей эффективностью, чем в случае исходной плазмиды рBR 322, что обеспечивает устойчивость штаммов, несущих плазмиду серии рSTH/P-tac, к пониженной концентрации тетрациклина (20 мг/л на твердой среде, 5-7 мг/л в жидкой среде). Рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-tac амплифицируются в клетках Е.соli при добавлении в среду хлорамфеникола, неконъюгативны. В. Сущность рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp, (pSTH 35-0/P-trp, pSTH 19-1/P-trp, pSTH 9-2/P-trp) состоит в том, что они содержат репликон плазмиды рBR 322, фрагмент, содержащий trp-промотор (промотор триптофанового оперона Е.coli) и фрагмент клонированной кДНК СТГЧ, содержащий укороченный вариант гена СТГЧ, а именно состоят из следующих элементов: плазмидная ДНК вектора рBR 322, размер которой 4300 п.о.; фрагмент ДНК, содержащий trp-промотор Е.сoli, который встроен между геном bla и EcoRI-участком расщепления плазмидной ДНК рBR 322, размером 800 п.о.; EcoRI - Hind III - фрагмент, содержащий укороченный ген СТГЧ, перед которым встроена последовательность ААТТСТАТG: первые 5 нуклеотидов которой являются частью сайта расщепления ЕсoRI, а последние 3 нуклеотида представляют собой инициирующий кодон АТG, за которым в индивидуальных плазмидных ДНК данной серии следуют последовательности, представленные ниже: pSTH 35-O/P-trp - TC CA AC AT CC ... pSTH 19-1/P-trp - CA AC AT CC TA ... pSTH 9-2/P-trp - AC AT CC TA TC ... В приведенных нуклеотидных последовательностях инициирующий АТG-кодон подчеркнут, цифры над триплетами обозначают номера кодонов зрелого СТГЧ. Молекулярная масса гибридных плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp равна 3,7 мд, размер 5800 п. о. ДНК-плазмид этой серии содержит уникальные сайты рестрикции EcоRV, BamHI, Hind III, Bgl II и EcoRI и два сайта рестрикции Pst I, что установлено путем расщепления плазмидных ДНК указанными ферментами и анализа продуктов гидролиза с помощью электрофореза в агарозном геле (см.табл.3) В состав рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp входят гены: STH - модифицированный ген СТГЧ, обеспечивающий синтез следующих производных этого гормона в случае индивидуальных плазмид данной серии: pSTH 35-0/Р-trp - Мет-СТГЧ pSTH 19-1/Р-trp - Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ pSTH 9-2/Р-trp - Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ bla - ген, обеспечивающий синтез -лактамазы; tet - ген, обеспечивающий устойчивость штаммов, несущих плазмиды к антибиотику тетрациклину. Репликация рекомбинантных плазмид осуществляется за счет репликона плазмиды рBR 322. Синтез производных СТГЧ осуществляется под контролем trp-промотора. Ген tet, расположенный дистально по отношению к последовательности, кодирующей производное СТГЧ, также экспрессируется под контролем trp-промотора, но с меньшей интенсивностью, чем в исходной плазмиде рBR 322, что обеспечивает устойчивость штаммов, несущих плазмиду серии рSTH/P-trp к пониженной концентрации тетрациклина (20 мг/л на твердой питательной среде, 5-7 мг/л в жидкой среде). Рекомбинантные плазмидные ДНК серии рSTH/P-trp амплифицируются в клетках Е. coli при добавлении в среду культивирования хлорамфеникола, неконъюгативны. II. Сущность способа конструирования предлагаемых плазмидных ДНК, кодирующих синтез производных СТГЧ, состоит в том, что в участок расщепления рестриктазы Hind III плазмидной ДНК рBR 322 вносят ДНК, комплементарную мРНК из аденомы гипофиза человека, продуцирующей повышенное количество СТГЧ, путем гибридизации с меченной кДНК, рестрикционного картирования и определения первичной структуры, отбирают рекомбинантную плазмиду, содержащую вставку ДНК, кодирующую предшественник СТГЧ, названную р-pre-STH-18. Для прямой экспрессии СТГЧ в Е.coli необходимо удалить из полученной рекомбинантной плазмиды р-pre-STH-18 нуклеотидные последовательности, соответствующие 5'-нетранслируемой области и кодирующие сигнальный пептид пре-СТГЧ. С этой целью плазмидную ДНК р-pre-STH-18 расщепляют рестриктазой ЕсоRV и обрабатывают экзонуклеазой III Е.coli и нуклеазой S 1 из Aspergillus orisae. Время инкубации и соотношение ДНК и фермента экзонуклеазы III подбирают таким образом, чтобы в результате было удалено 250-300 нуклеотидов одной цепи от конца фрагмента, поскольку расстояние от ЕсоRV-сайта до 1-го кодона зрелого СТГЧ составляет в плазмиде р-pre-STH-18 269 нуклеотидов. К смеси полученных линейных молекул плазмидной ДНК пришивают синтетический олигонуклеотид, содержащий участок расщепления ЕсoRI и инициирующий кодон АТG, затем после расщепления рестриктазами ЕсоRI и Hind III смесь продуктов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, выделяют фрагменты размером около 700 п.о., сшивают их ДНК лигазой фага Т4 с векторной плазмидой рBR 322, также расщепленной рестриктазами ЕсоRI и Hind III, полученной смесью молекул ДНК трансформируют клетки Е.coli, отбирают клоны устойчивые к ампицилину, но потерявшие устойчивость к тетрациклину, и анализируют методом рестрикционного картирования плазмидные ДНК, выделенные из клонов. Из полученной коллекции плазмид путем определения нуклеотидной последовательности, прилегающей к ЕсоRI-сайту, отбирают те, в которых искусственный АТG-кодон, происходящий из синтетического линкера, находится в рамке считывания с последовательностью, кодирующей СТГЧ. Таким образом, получают разные варианты укороченного гена СТГЧ, часть из которых более подробно охарактеризована в приведенных в заявке примерах (плазмидные ДНК рSTH). Далее в участок расщепления ЕсоRI, происходящий из синтетического линкера и расположенный непосредственно перед АТG-инициирующим кодоном, встраивают фрагмент ДНК, содержащий бактериальный промотор, такой как двойной lac UV-5-промотор или гибридный tac-промотор, обеспечивающие синтез одного из производных СТГЧ, после введения этих плазмид в клетки E.coli. Для получения плазмидных ДНК серии рSTH/P-trp плазмидные ДНК серии pSTH гидролизуют рестриктазами BamHI и EcoRI, выделяют фрагмент размером 1050 п. о. и встраивают его по тем же сайтам в плазмиду рВР-trp, содержащую trp-промотор. Штаммы - продуценты производных СТГЧ - получают трансформацией клеток Е. coli K 802 одной из предложенных рекомбинантных плазмидных ДНК. Уровень синтеза производных СТГЧ в сконструированных штаммах составляет при плотности культуры 4х10⁸ 2-2,5 мг/л в случае плазмид серии рSTH/P-lac (pSTH 19-1/P-lac), 4-6 мг/л в случае плазмид серии pSTH/P-tac (pSTH 19-1/P-tac), 7-8 мг/л в случае плазмид серии рSTH/P-trp (pSTH 19-1/P-trp). Все штаммы Е.coli К 802, содержащие рекомбинантные плазмидные ДНК одной из предложенных серий, характеризуются следующими общими признаками. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. При росте на питательном агаре Дифко колонии гладкие, круглые, блестящие, серые, края колоний ровные. При росте в жидких средах УТ LB образуют ровную интенсивную муть. Физико-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37^оС, оптимум рН 6,8 - 7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной или нитратной форме, так и органические в виде пептона, триптона, аминокислот. Устойчивость к антибиотикам. Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды. Проявляют устойчивость к тетрациклину, 20 мг/л на агаре, 5-7 мг/л в жидкой среде. Предложенные штаммы содержат плазмидные ДНК серий рSTH/P-lac, pSTH/P-tac или рSTH/P-trp. Присутствие в штаммах плазмидных ДНК подтверждается путем проверки их устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК одним из известных методов. Штаммы депонированы во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под следующими номерами. 1. Штамм Е. coli K 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 38+4/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-Глу-Гли-Сер-Ала-СТГЧ, под номером ВКМ R13-D. 2. Штам Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 33+3/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-Гли-Сер-Ала-СТГЧ, под номером ВКМ R14-D. 3. Штамм Е. coli K 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 35-0/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-СТГЧ, под номером ВКМ R15-D. 4. Штамм Е. соli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 19-1/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ, под номером ВКМ R16-D. 5. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК pSTH 9-2/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, под номером ВКМ R17-D. 6. Штамм Е. coli K 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 12-4/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ, под номером ВКМ R18-D. 7. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 14-10/P-lac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)- СТГЧ, под номером ВКМ R19-D. 8. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 35-0/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-СТГЧ, под номером ВКМ R20-D. 9. Штамм Е.coli 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 19-1/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ, под номером ВКМ R21-D. 10. Штамм Е.соli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 9-2/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, под номером ВКМ R22-D. 11. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 12-4/P-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴)-СТГЧ, под номером ВКМ R23-D. 12. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 14-10/3-tac, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²-Тре³-Иле⁴-Про⁵-Лей⁶-Сер⁷-Арг⁸-Лей⁹-Фен¹⁰)- СТГЧ, под номером ВКМ R24-D. 13. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 35-0/P-trp, обеспечивающую синтез Мет-СТГЧ, под номером ВКМ R25-D. 14. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК pSTH 19-2/P-trp, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹)-СТГЧ, под номером ВКМ R26-D. 15. Штамм Е. coli К 802, содержащий плазмидную ДНК рSTH 9-2/P-trp, обеспечивающую синтез Мет-(дез-Фен¹-Про²)-СТГЧ, под номером ВКМ R27-D. Способы получения рекомбинантных плазмидных ДНК серий рSTH/P-lac, pSTH/P-tac и pSTH/P-trp иллюстрируются следующими примерами. П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК серии рSTH. А. Конструирование плазмидной ДНК р-pre-STH-18, содержащей полную копию кДНК СТГЧ. Выделение поли(А)-РНК из аденомы гипофиза человека. 800 мг аденомы гипофиза, удаленной во время операции, разбивают на кусочки в замороженном состоянии и без предварительного оттаивания разрушают в стеклянном гомогенизаторе Поттера в течение 3 мин (скорость вращения пестика составляет 1200 об/мин) в 10 мл 4 М гуанидитиоцианата, содержащего 0,5% лаурилсаркозина натрия, 0,25 мМ цитрата натрия, рН 7,0, 0,1 М меркаптоэтанола, 0,1% пеногасителя (Antifoam A,Сигма) при комнатной температуре. В три пробирки от ротора SW 50,1 (Бекман) вносят по 1,2 мл 5,7 М раствора хлористого цезия (плотность 1,709), забуференного ацетатом натрия, рН 7,0, и отстерилизованного 0,2% -ным раствором диэтилпирокарбоната. Затем в каждую пробирку осторожно насливают полученный гомогенат и центрифугируют при 36 000 об/мин (120000 G) 12 ч при 20^оС. Осадок РНК растворяют в 0,2 мл 0,2 М хлористого натрия и переосаждают два раза этанолом. Осадок растворяют в 0,5 мл 1 мМ ЭДТА, рН 7,0, и измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм. Далее раствор РНК прогревают 5 мин при 70^оС, быстро охлаждают и добавляют к нему до концентрации 0,5 М, 10 мМ и 0,2%-ной хлористый натрий, трис-НСl, рН 7,5, и додецилсульфат натрия соответственно. 1 мл такого раствора наносят на колонку олиго(dT)-целлюлозы. 20 мг олиго(dT)-целлюлозы Т-7 (Р-L Biochemicals, Inc., США) замачивают в дистиллированной воде для набухания в течение 1 ч. Полученной суспензией заполняют колонку, приготовленную из наконечника для автоматической пипетки объемом 1 мл. Объем олиго(dT)-целлюлозы в колонке составляет 100 мкл. Колонку промывают 0,5 мл 0,1 н. NaOH, отмывают водой до рН 7,0 и уравновешивают, пропуская через нее 30 объемов (3 мл) буферного раствора 0,5 М NaCl, 10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 0,2% SDS. Далее на колонку наносят препарат РНК в 1 мл буфера того же состава, промывают ее 2 мл того же буфера. Поли(А)-РНК элюируют 10 мМ трис-НСl буфером, рН 7,5, содержащим 0,2% SDS. Собирают 250 мл элюата. Скорость попротока буфера при уравновешивании колонки, нанесении образца, промывке и элюции составляет 3 мл в 1 ч. Фракции с поли(А)-РНК переосаждают дважды этанолом и хранят под этанолом при -20^оС. Для анализа препаратов поли(А)-РНК используют электрофорез в кислых денатурирующих агарозных гелях следующего состава: 1,6% агароза, 6 М мочевина, 0,025 М ацетат натрия, рН 5,0. Перед нанесением на гель высушенные образцы РНК растворяют в растворе 0,025% бромфенолового синего, 7 М мочевины, 20% сахарозы, 0,025 М цитрата натрия. Синтез двухцепочечной кДНК (дцк ДНК). Синтез дцкДНК осуществляют по методу, описанному Seeburg P.et al. Nature, 1977, 270, N 8, р.486-494. В качестве матрицы для обратной транскриптазы используют поли(А)-РНК, выделенную из аденомы гипофиза человека. Затравкой служит олиго(dT) 12-18 фирмы "Р-L Biochemicals, Inc. ", США. Реакцию проводят в 100 мкл инкубационной смеси следующего состава: 70 нг поли(А)-РНК, 200 мкг/мл олиго(dT) 12-18, 50 мМ трис-НСl, рН 8,1, 20 мМ хлористого калия, 7 мМ хлористого натрия, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ -меркаптоэтанола, 500 мкМ dАТР, dGTP, dTTP, 50 мкМ, dСТР, 1,25 мкМ (-³²Р)-dСТР (50 мкКи), 5 ед. (4 мкл) обратной транскриптазы. После инкубации в течение 2 ч при 42^оС реакцию останавливают добавлением ЭДТА, рН 8,0, до конечной концентрации 10 мМ, затем проводят экстрацию равным объемом фенола, насыщенного ТЕ-буфером, и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Осадок растворяют в 30 мкл 5 мМ трис-НСl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом G-50. Колонку с сефадексом G-50 (Superfine, Farmacia) объемом 1,8 мл (h=10 см, s = 0,17 см²) уравновешивают 5 объемами буфера следующего состава: 5 мМ трис-НСl, рН 7,5, 1 мм ЭДТА. Гель-фильтрацию проводят в том же буфере. Скорость нанесения препарата и элюции 0,4 мл/ч. К фракциям кДНК (200 мкл) добавляют 1 мкл тРНК-носителя (1 мг/мл) и 3 объема этанола, охлаждают 10 мин при -70^оС. кДНК осаждают центрифугированием (10000G, 10 мин). Осадок промывают этанолом и растворяют в 50 мкл 0,1 н. NaOH, 1 мМ ЭДТА. Полученный раствор прогревают 20 мин при 70^оС для деградации РНК, затем нейтрализуют 0,1 н. соляной кислотой и снова переосаждают этанолом. После предварительной денатурации одноцепочечной ДНК проводят достройку второй цепи в полимеразном буфере в присутствии всех четырех dNТР в концентрации 400 мкМ и 5 единиц (2 мкл) ДНК-полимеразы 1 E. coli 2 ч при 40^оС. После реакции смесь экстрагируют 2 объемами фенола и кДНК осаждают этанолом. Осадок растворяют в 30 мкл 5 мМ трис-НСl, 1 мМ ЭДТа и фракционируют на колонке с сефадексом G-50, как описано выше. Фракции, содержащие двухцепочечную кДНК, осаждают спиртом. Обработку нуклеазой S1 проводят в инкубационной смеси, содержащей 300 мМ хлористого натрия, 30 мМ ацетата натрия, рН 4,5, 3 мМ хлористого цинка, в присутствии 5 ед. фермента (1 мкл) 10 мин при 37^оС. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ, после чего ДНК осаждают этанолом. Достройку ДНК до образования "тупых" концов проводят 2 ед. (1 мкл) ДНК-полимеразы 1 E.coli в течение 10 мин при 10^оС в 25 мкл следующей инкубационной смеси: 200 мкМ каждого dNTP, 60 мМ трис-НСl, рН 7,5, 8 мМ хлористого магния, 10 мМ -меркаптоэтанола, 1 мМ АТР. Фосфорилирование и присоединение синтетических линкеров и фракционирование кДНК. Фосфорилирование 200 пмолей линкера проводят в следующей инкубационной смеси: 50 мМ трис-НСl, рН 9,0, 10 мМ хлористого магния, 5 мМ дитиотрейтола, 0,1 мМ АТР в приcутcтвии 5 ед. (2 мкл) полинуклеотидкиназы фага Т4 и 20-50 мкКи (-³²Р)-АТР в течение 30 мин при 37^оС. Далее добавляют АТР до конечной концентрации 0,5 мМ, 10 ед. (4 мкл) киназы и инкубируют еще 30 мин. Фосфорилированный линкер отделяют от АТР на колонке с сефадексом G-50. Для приготовления сефадекса G-50 и гель-фильтрации используют дистиллированную воду. Объем колонки составляет 1 мл, скорость нанесения препарата и элюции 2,4 мл/ч. Фракции анализируют электрофорезом в 20% ПААГ с 7 М мочевиной с последующей авторадиографией геля. Нужные фракции объединяют и лиофилизируют. 50 пмоль линкера растворяют в 15 мкл буфера для ДНК-полимеразы 1 и добавляют к препарату кДНК. Лигирование проводят в присутствии 50 ед. (1 мкл) ДНК-лигазы фага Т4 12 ч при 15^оС. После этого добавляют 100 мкл буфера: 6 мМ хлористого магния, 60 мМ хлористого магния, 60 мМ -меркаптоэтанола, нагревают 5 мин при 80^оС и охлаждают. К реакционной смеси добавляют 20 ед. (2 мкл) рестриктазы Hind III и инкубируют 3 ч при 37^оС. Полноту лигирования и расщепления рестриктазой проверяют электрофорезом в 8- и 20% ПААГ с последующей авторадиографией. Нужные для клонирования фракции ДНК (размером 750-850 н.п.) получают путем элюции из препаративного 5% ПААГ. Приготовление ПААГ, электрофорез и выделение фрагментов ДНК проводят по следующей методике. Гель приготовляют из концентрированных запасных растворов акриламида : бисакриламида (30: 1), 20-кратного буфера (1 М трис-НСl, борная кислота, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3), воды, катализатора и инициатора полимеризации. Раствор без инициатора полимеризации фильтруют через хроматографическую бумагу (ватман 3 мм), затем дегазируют, после чего добавляют инициатор полимеризации (ТЭМЭД) и быстро вливают в форму. Количество катализатора (персульфат аммония) составляет 1 мг/мл, а ТЭМЭД добавляют из такого расчета, чтобы полимеризация заканчивалась через 10 мин после заливки формы. Концентрация мономера составляет 5%. До нанесения образцов гель подвергают преэлектрофорезу в течение 1 ч при напряжении 70% от рабочего. Электрофорез проводят при токе 30 мМ. Об окончании разделения препаратов ДНК судят по миграции маркерных красок. Локализацию кДНК в геле определяют путем радиоавтографии. Далее вырезают из геля полосу, соответствующую фрагментам ДНК размером 750-850 п. о. Для элюции ДНК кусочек геля измельчают растиранием в сухой пробирке стеклянной палочкой, добавляют 10 мкг тРНК-носителя, два объема элюирующего буфера: 125 мМ хлористого натрия, 25 мМ трис-НСl, рН 7,5,6 мМ ЭДТА, и инкубируют в течение ночи при 37^оС. Суспензию геля центрифугируют при 4000 об/мин (1800 G) 5 мин и супернатант фильтруют через стекловату. Гель промывают 1 объемом буфера, снова центрифугируют и супернатант фильтруют. К полученному элюату при комнатной температуре добавляют по каплям 1% -ный раствор цетавлона (цетилтриметиламмоний бромистый) до конечной концентрации 0,1%. Смесь оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем помещают в холодильник на 30 мин. Раствор центрифугируют при 10000 G 10 мин при 4^оС и супернатант сливают. Осадок ДНК растворяют в 3 М ацетате натрия, рН 6,0, добавляют три объема этанола и охлаждают в бане сухого льда с этанолом (-70^оС) 10 мин. Затем центрифугируют 10 мин при 10000 G и при -20^оС. Осадок растворяют в 0,3 М ацетате натрия до рН 6,0, переосаждают еще раз, промывают 96%-ным этанолом и высушивают. Клонирование кДНК в векторной плазмиде рВR 322. 2 мкг плазмидной ДНК рВR 322 гидролизуют рестриктазой Hind III в инкубационной смеси объемом 50 мкл, содержащей 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтола, 2 ед. (2 мкл) рестриктазы Hind III, в течение 1 ч при 37^оС. Затем проводят двукратную экстракцию равным объемом фенола, насыщенного ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), двукратную экстракцию равным объемом хлороформа и плазмидную ДНК осаждают спиртом. Далее плазмиду обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой (1 мкг фермента на 1 мкг плазмиды) в 100 мМ трис-НСl, рН 8,0, при 65^оС в течение 30 мин. Смесь экстрагируют фенолом два раза, хлороформом два раза и ДНК переосаждают спиртом. 1 мкл раствора плазмидной ДНК (0,1 мкг) смешивают с 5 мкл раствора кДНК с пришитым Hind III - линкером и лигируют полинуклеотидлигазой фага Т4 в 20 кмл инкубационной смеси, содержащей 1 мМ АТР, 20 мМ трис НСl, рН 7,5, 10 мМ дитиотрейтола, 10 мМ хлористого магния и 20 ед. (1 мкл) лигазы, 1-2 ч при 15^оС. Далее инкуба