Способ получения пировиноградной кислоты
Иллюстрации
Показать всеРеферат
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН г
1 л
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пирооииогр.л-то.г/о
/лицгрии, I/þ гл ОE 73 лб /гО /О9
Вргир луллтибироболил иогы ииг f
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ (21) 3918629/28-13 (22) 28.06.85 (46) 07.08.86. Бюл. № 29 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Экспери- ментальный завод биохимических препаратов АН ЛатвССР (72) Т.В.Финогенова, P.ß.Карклинь, И.Т.Ермакова, Н.В.Шишканова и И.Ж.Пелцмане (53) 661.733:576.8 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
¹ 386989, кл. С 12 D 13/00, 1973.
Agric.Biol.Chem.,1983, 47, 2619.
„„SU„„1249069 А1 (51) 4 С 12 Р 7/40//С 12 R 1:73 (С .12 P 7/40 С 12 R 1:73 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ путем аэробного куль- тивирования продуцирующих Ее дрожжей Candida Vipn Kytica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии глицерин, а также источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода продукта, глицерин вносят в начале процесса,а затем поддерживают концентрацию его не ниже 1 г/л путем периодической подпитки в таких количествах,чтобы концентрация непосредственно после внесения не превышала 46 г/л.
1 !2
Изобретение относится к области микробиологического получения органических кислот, в частности пировиноградной кислоты, и может быть использовано в микробиологической, химической, пищевой и медицинской промышленности.
Пирониноградная кислота может служить как исходный материал для производства таких аминокислот, как триптофан, тироэин или алании, а также используется как добавка к продуктам для придания им кислого вкуса.
Целью изобретения является повышение выхода пировиноградной кислоты.
Выход пировиноградной кислоты может быть значительно увеличен путем дискретной подачи глицерина. н среду (периодической подпитки) в процессе культивирования. При таком способе (табл.1) внесения субстрата количество накапливающей,ся н культуральной жидкости кислоты в 1,5 выше, а период ферментациив 1,4 раза короче по сравнению со способом, где то же количество глицерина вносится одноразово н начале культивирования.
Влияние дискретной подачи глицери. на на выход пирувата (Candida VipoYytica 695, культивирование в колбах на качалке J приведено в табл. 1.
При дискретном способе подачи глицерина последний вносят в среду в таких количествах и через такие промежутки времени, чтобы его концентрация непосредственно после внесения .не превышала 46 г/л. Как видно из табл,2, при концентрации глицерина в среде до 46 г/л количество кислоты увеличивается пропорционально количеству субстрата. При содержании же его в среде 50 г/л и выше наблюдается значительное снижение выхода пирониноградной кислоты вследстние ингибирующего влияния высоких концентраций глицерина на дрожжевые клетки.
В процессе культивирования нецелесообразно допускать снижение концентрации глицерина ниже г/л, так как это приводит к полному потребпению субстрата за кброткий промежуТаК времени и приостановке процесса ферментации.
Влияние концентрации глицерина в среде на выход пировиноградной кис49069 2
S0
20
55 лоты у С. (ipo Eytica 695, приведено в табл.2. .Увеличение выхода пировиноградной кислоты и сокращение времени фермента ции при дискретном способе подачи глицерина н среду поясняется примера— ми и табл.1.
По способности к биосинтезу пировиноградной кислоты (табл.3) проверенные штаммы Candida Oipofytica не имеют существенных отличий от штамма, используемого н прототипе, при культивировании их в идентичных условиях (н колбах на качалке в среде с глицерином.
Содержание пировиноградной кислагы в культуральной жидкости дрожжей
Candida Iipo Eytica приведено в табл.3..
Пример 1. Опыт. Дрожжи
Сапй da (ipoEytica 695 (ВКМ вЂ” У-2378) выращивают н течение 2 сут при 2830 С в пробирках па агаризованной минеральной среде Ридер следующего состава, г/л: глицерин 20,
30; NgS0 7Н007; МаС1 05;
Са(ИОз)2 0«4;,КН РО 1,0, К НРО 0,1, агар-агар 25; дрожжевой автолизат
2 мп; микроэлементы (смесь Буркгольцера), мг/л: KI 0,1, В" 0,01;
Hn 2 0,01;Zn+ - 0,01; Cu 0,01; !!о 2 0,01, Ре 0,05; вода бидистил- лированная.
Клетки из одной пробирки смьгвают
5 мл стерильной дистиллированной воды в колбу объемом 750 мл с 50 мл среды следующего состава, г/л: глицерин 20 (NH„) 80 3,0, МАМБО «
«7! О 07; Са(МО) О,"; к!аС 05;
КН Р0 1,0; К НРО 0,1; тиамин
2 мкг/л, микроэлементы по прописи
Буркгольдера, вода бидистиллированная.
Посевной материал выращивают
24 ч на качалке 220 об/и/мин/ при
28-30 С. Колбы в опытных вариантах засевают из расчета 100 мг клеток (по несу сухой биомассы) на 1 л среды того же состава, которая использовалась для выращивания посевного материала, но количество глицерина увеличивают до 60 г/л и его вносят по 20 г/л н .начале, и через 36 и 72 ч культивирования, когда концентрация в среде соотвестненно снижается до 5 и !О г/л. Таким образом, концентрация глицерина сразу после внесения составляет в
3 249069 начале процесса 20 г/л, чер -.
25 г/л, через 72 ч — 30, г/л ?фпг:!,, ю
Культивирование ведут в колбах в на качалке до полного потребления субстрата при рН 3,5-6,0 (поддерживают добавлением 5Х-ного раствора 2
Na0H). Изменение концентрации глице- 2 рина в процессе ферментации от 5 ц до 30 г/л не оказывает влияния на д динамику накопления кислоты (Фиг. 1) .,О к
Через 5 сут культивирования в н среде накапливается 36 4 г/л пиро- и виноградной кислоты, что состав- ляет. 60,77. от потребленного субстрата. л
HocToЯппый ypoBенъ р11 пОддержива т путем нейтрализации 10/ — ным ðañòором NaÎH.
Глицерин вносят .следующим обраом 20 г/л в начале процесса и Io
0, 10, !5, 35 г/л через 12, 23, 6 и 32 ч выращивания, — îãäà его конентрация соответственно снижается о 3,1 5 и 11 г/л. Таким образом, онцентрация глицерина непосредствено после внесения в среду в разные ромежутки времени составляет 20,23, 1,20, 46 г/л.
За 50 ч происходит полное потребение гпицерина и накапливается
51,8 г/л пирувата. Изменение концентрации глицерина oT до 46 г/л не оказывает влияния на динамику накопления кислоты (фиг.2}.
Контроль. Культивирование ведут как в опытном варианте, но 100 г/л глицерина вносят в начале процесса.
Ферментация заканчивается к 72 ч, в среде обнарлкено 38,5 г/л пирови25 нОграднОи кислОты
Таким образом, пр?? дискретной подаче глицерина выход кислоты увеличивается в 1,34 5, а время ферментации сокращается почти в 1,5 pagp за
Пример 3 . Культивирование ведут, как в примере 2, но ОО г/л глицерина вносят следующим образом:
20 г/л в начале ферментации, затем
44 и 36 г/л через 12 и 38 ч культи
35 вирования, когда его концентрация соответственно снижается до 5 и 10 г/л.
После внесения глицерина она составляет 49 г/л после первой и 46 г/л Г
40 после второй добавки.
Последующее культивирование с целью получ ения п иро в ино r рад ной кислоты проводят в ферментере объемом 10 л с 5 л среды, имеющей такой же состав минеральных солей, как и среда для посевного материала. Концентрацию тиамина снижают до 4 мкг/л, О количество глицерина увеличивают до
100 г/л.
Контроль. Выращивание дрожжей ведут как в опытном варианте, но
60 г/л глицерина вносят одноразово в начале культивирования. Субстрат полностью потребляется за 7 сут, за это время накапливается 24,2 г/л пирувата (выход 40,3 7 от потребленного глицерина).
Таким образом, при дискретном внесении глицерина в среду количество образующегося продукта увеличивается в 1,5 раза, а время ферментации сокращается.на 48 ч.
Пример 2. Опыт. Дрожжи
CaIIdida 3ipnEytica 695 (ВКИ Y-2378) выращивают на агаризованной среде как в примере 1 Для приготовления посевного материала используют сре— ду следуюп?его состава, г/л: глицерин 30; (NH4) 804 6 0, Mg S04 7H 0
1,4; NaC!. 0,5; Са(ИОз)г 0,8;
НРО4 ты — удвоенная концентрация (по сравнению со смесью Буркгольдера1, тиамин 6 мкг/л. Посевной материал выращивают в колбах на качалке (220 об/мин)24 ч.
Посевной материал вносят из расчета 0,4-0,5 г/л (по сухому весу) .
Культивирование проводят при 29 С, рН 4,5, концентрации растворенного кислорода 607-от насыщения.
Ферментация заканчивается через
58 ч, выход кислоты составляет
42, 4 г/л (42, 4Х от потребленного субстрата). Так?п? образом, увеличение концентрации глицерина в среде до 49 г/л при дискретной его пода†че на 9,4Е сниж ет выход пкрувата (по сравнению с примером 21 и на 8 ч увеличивает время ферментации.
Таким образом, культивирование дрожжей Candida fipokytica по предлагаемому способу на среде, содержащей в качестве источника углерода непищевое сырье, — глицерин позволяет увеличить накопление пировиноградной кислоты в культуральной жидкости в
4,6-6,1 раза по сравнению с извест-, 1?49069 ным способом и в 1,15-1,2 раза по сравнению со,способом, по которому до настоящего времени был получен лучший выход пировиноградной кислоты — 43,6 г/л,но согласно которому используют в качестве источника углерода пищевое сырье — глюкозу и дефицитную незаменимую аминокислоту— метионин.
Пировиноградная кислота
Способ внесе-.
Количество глицерина. г/л
Длит ел ьность ферментации ч г/л ния
36,4
60,7
120
Одноразовый
40„3! 68
Таблица2
Концентрация глиЦерина, г/л
l г/л
49,2
2,46
51,0
10,3
51,5
23,4
50,8
17,3
39,6
24,2
40,3
Т аб л иц а3
П1таммы
Пировиноградная кислота, г/л
Итаммы Пировиноград ная кислота, г/л
212
8,4
704
9,4
668
8,5
596
6,2
695 10,3
А 14353 8 5
585
10,1
682
6,4
672
9,6
Итамм, используемый по известному способу.
60(20+20+20 ) Дискретный
Кроме того, как видно из предстаE ленного материала, дискретное внесение глицерина в среду в процессе культивирования по сравнению с одноразовым внесением увеличивает также выход пировиноградной кислоты от потребленного субстрата в 1,341,5 раза и сокращает время фермен1о тации в 1,4-1,44 раза.
Таблица ировиноградная кислота
1249069
Пиробииогр. к-та, л
/лицевав, /,7
20 30 Ю Ю бремя купьти5иро5ания, часы
Фиг. г
Составитель Н.Афанасьева
Редактор П.Коссей Техред В.Кадар Корректор Е.Сирохман
Заказ 4202/27 Тираж 490 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãîðîö, ул. Проектная, 4