Способ повышения иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба

Способ повышения иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

С01ОЭ советских социАлистических

РЕСПУБЛИК (д1) 4 С 12 Q 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3784484/28-14 (22) 25.08.84 (46) 15.03.87. Бюл. В 10 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) Г.И. Васильева, А.К. Киселева и Е.П. Дорошенко (53) 576.8.093.35 (088.8) (56) Леви М,И., Чекомасов А.B, Васильев Н.В. Изучение возможности повышения приживаемости и иммуногенностн живой авирулентной вакцины против чумы. Пассирование вакцинного штамма 1 на белых мышах, — Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1960, 8, с. 105-117.

„„SU„,, 1249939 А1 (54)(57) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕН.НОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ЧУМНОГО

МИКРОБА путем пассирования культуры микроорганизмов с последующим выде- лением культуры, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью ускорения способа, пассирование проводят через культуру макрофагов, субкультуру чумного микроба добавляют к макрофагам в соотношении 50: 1, инкубируют в течение 20-24 ч и для последующего пассажа используют микробные,клетки, выделенные из разрушенного монослоя макрофагов предыдущего пассажа.

1 12499

Изобретение относится к медицинской микробиологии.

Целью изобретения является ускорение способа эа счет исключения использования живого организма.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Перитонеальные макрофаги получают промыванием брюшной полости морских свинок 20 мл 10 среды 199 с гепарином (5 ед/мл), содержащей 203 сыворотки крови человека, инактивированной при 56 С в течение 30 мин, Определяют концентрацию макрофагов путем:подсчета в 15 камере Горяева и добавляют взвесь субкультуры Y, pestis EV, выращенной в течение 1 сут, при 28 С на агаре Хоттингера (рН 7,2) таким образом, что соотношение количества 20 макрофагов и числа микробов составляет 1:50.

Приготовленную взвесь макрофагов с бактерияии разливают по 1 мл в 25 стерильные пенициллиновые флаконы (по 3-4 флакона на одну субкультуру), которые закрывают стерильными резиновыми пробками и инкубируют при

37 С в течение 1 ч. За это время 30 макрофаги прикрепляются к стеклу, -. после чего флаконы вынимают из тер" мостата. Прикрепившийся слой клеток промывают средой 199 для удаления неприкрепившихся клеток.и внеклеточно расположенных микробов и заливают

2 мп среды 199, содержащей 20Х инактивированной сыворотки крови человека. Среду заменяют свежей через

6-8 ч культивирования при 37 C и про-10 должают инкубировать при этой тем- пературе еще 13-15 ч (всего 20-24 ч), после чего среду культивирования сливают и к оставшемуся на стенке . флакона слою макрофагов добавляют

0,2 мп дистиллированной воды, осторожно снимают пипеткой монослой макрофагов и Фпакон встряхивают. Макрофаги при этом разрушаются, и расположенные внутри них микроорганизмы выс-50 вобождаются. Полученной вэвесью; микробов, собранных из 3-4 флаконов (первый пассаж субкультуры),.инфицируют свежие макрофаги для получения следующего пассажа. Всего проводят

20 пассажей.

Параллельно проводят пассирование этой же субкультуры Y. pestis EV на морских свинках массой 250-300 г.

39 2

Двусуточную культуру, выращенную при

28 С на агаре Хоттннгера (pH- 7,2), вводят подкозно в дозе 5 10 микробных клеток 2-3 морским свинкам. Так как животные от указанных доз не погибают, нх забивают на 5-7-е сутки, делают высевы из места введения куль-. туры, лимфатического узла, печени, " селезенки на соответствующие питательные среды и полученной субкультурой вновь заражают животных. Всего проводят 20 пассажей.

Иммуногенность исходных .и пассированных субкультур определяют на белых мышах массой 18-20 г по крите! рию Хш0 - количеству микробных клеток, способных предохранить через 21 сут 503 взятых.в опыт животных от 200 DC1 вирулентного штамма

:,чумного микроба. В качестве вирулентйого штамма используют Y. pestis

361(1) 1479, 1 DC1 которого составляет 25 микробных клеток. Полученные результаты приведены в табл. 1, из которой видно, что используя предлагаемый способ, мозно значительно повысить иммуногенность вакцинного штамма чумного микроба и в более короткий срок, чем при пассивировании обычным способом. Так Хий еуб50 культуры 10 пассажа на макрофагах соответствует ImD субкультуры 20 пассажа на морских свинках и в

25 раз превосходит ?пй) исходной субкультуры. Дальнейшее пассирова-,. ние на макрофагах еще больше повышает иммуногенность субкультур.

Так, ImD .субкультуры 20 пассажа на макрофагах в 70 раз превосходит

ImD исходной субкультуры и значительно выше ImD субкультуры, пассированной 20 pas на морских свинках.

Данные по количеству жизнеспособных микробов при использовании макрофагов приведены в табл, 2.

Способ позволяет быстро повысить иммуногенность субкультур вакционного штамма чумного микроба. Для получ ния одной и той же величины иммуногенности предлагаемым способом (in vitro) требуется 10 пассажей, а обычным (in vivo) — 20. Если учесть, что каждый пассаж in vitro занимает 1 сут, а in vivo — 1О сут, то один и тот зе иммуногенный эффект достигается способом по изобретению

1 в 20 раз быстрее, чем.известным способом (10 дней вместо 200 дней соот. ветственно).

1249939

Таблица 1

Данные по иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба

ImD ImD О мин 50 маке

Субкультура ImD

5о

50000

Исходная

24400

130000

50000

24400 130000

6000

3160

11480

1050

3800

520

f900

700

360

1350

50000

24400 130000

16800.

7760

28200

11480

3160

8000

4800 Таблица 2

Количество жизнеспособных чумных бактерий в монослое макрофагов в зависимости от микробной нагрузки

Отсутствие микробов внутри макрофагов

1: 10

10-15Х макрофагов содержат чумные бактерии (1-? м.кл,) 2 <10 (1-5 ° 10 ) 1:25

4 >:10 (2,5-6 ° 10 ) 1:50

Пассированная ин витро, число пассажей:. 5!

О 2000

15 1000

Пассирован- 1 ная ин виво, число 5 пассажей:

10 6000

15 .4000

20 2300

1300

80-90Х макрофагов содержат микроколонии чумното микроба (50-90 м.кл.) 1249939

ПРодолжение теол. 2.1,5д10 (5 ° 10-4 10 ) Редкий слой макрофагов; оставшиеся на стекле макрофаги разрушены, внеклеточно расположенные микробы

1: 100

На стекле единичные разрушенные макрофаги, клеточный детрит

1! 200

Количество микробов определяют высевом ряда десятикратных разведений на агар Хоттингера (рН 7,2). Учет осуществляют через 48 ч инкубации при 28 С, Составитель В. Дроздов

Техред Н.Глущенко

Корректор Л. Патай

Редактор Е. Хорина

Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 804/2

Подписное

Производственно-полиграфйческое предприятие, /г. Ужгород, ул. Проектная, 4