Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов

Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 C 12 N 1/00, С 12 q 1/00 CI 2 1 00 С 12 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1.д

К АВТОРСКОМУ/ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

3»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3774503/28-13 . (22) 20.07.84 (46) 30.08.86. Бюл. Р 32 (71) Институт микробиологии и виру-, сологии АН КазССР (72) А,H.Èëÿëåòäèíîâ, С.А.Абдрашито.ва и С.А.Айткелъдиева (53) 576,8.093.1(088.8) (56) Романенко В.И., Кузнецов С.И., Экология микроорганизмов пресных вод. И.: Наука, 1974. (54) (57) СПОСОБ ВЬ1ПЕЛЕНИЯ ИИКРООРГАНИЗИОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОЛИРЕДУКТАЗНЫКИ

СВОЙСТВАМИ, ИЗ ПРИРОДНЫХ СУБСТРАТОВ, .,Я0„„1253999 A1 включающий получение накопительной культуры в анаэробных условиях, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени выделения микроорганизмов — полиредуктантов, после получения накопительной культуры осуществляют ее посев на рыбопептонный агар и ведут культивирование в аэробных условиях, после чего выделяют чистые культуры микроорганизмов и проводят их посев на питательные .среды для выявления способности полученных культур к сульфатредукции и нитритообразованию.

° .

Изобретение относится к области микробиологии.

Цель изобретения — сокращение времени выделения микроорганизмовполиредуктантов.

Сущность способа заключается в следующем. Исследуемую пробу высевают в 3-5 параллельнык рядов пробирок, которые затем доверху заливают средой накопления (среда Штурм) и закрывают резиновыми пробками.

Среда иаконления имеет следующий состав дистиллированной воды, г/л:

Лактат кальция

Аммоний сернокислый

Фосфат калия, однозамещенный

Сульфат магния

Сульфат кальция

Соль Мора

1 .-нъ|й раствор сульфида натрия

1,0

0,5

1,0

0,5

0,5

1 мл

Все выросшие на РПА колонии выделяют в чистой культуре на скошенный РПА и затеи проверяют их способность к восстановлению нитратов и сульфатов. Суспензвю чистых культур высевают в среду для выращивания факультативно-анаэробных денитрифицирующих микроорганизмов (среда Гильтая) следующего состава дистиллированной воды, г/л:

Ю

Аспарагин 0,5

Глюкоза 10 О

Нитрат калия 2,0

Натрий лиммонHq-кислый .2,5

Фосфат калия, однозамещенный 2,0

Сульфат магния 2,0

Хлористый кальций 0,2

Хлорное железо Следы

Бромтимолблау 0,1%

Изменение окраски среды от зеленоватой до синей через неделю инкубации, происходящее при подщелачива- !

Через 10-14 дней инкубации при

;28 С, когда визуально наблюдают по- ернение среды, свидетельствующее о наличии процесса сульфатредукции, производят посев среды из накопительной культуры в чашки Петри на поверхность рыбопептонного агара (РПА) в 10-20 кратной повторности.

3,5

Лактат кальция

Сернокислый аммоний

Фосфат калия, однозамещенный

Сульфат магния

Сульфат кальция

Соль Мора

1%-ный раствор сульфида натрия

Агар

1,0

0,5

0,5

0,5

0,5

1 мл

15-20

0 развитии процесса сульфатредукции,судят по образованию черных колоний в толще агаризованной среды.

Наличие роста на всех предлагаемых средах с образованием соответствующих восстановленных продуктов (нитрит-иона, газообразного азота, сероводорода) указывает на возможность проявления выделенными культурами микроорганизмов полиредуктазных свойств. С отобранными таким образом штаммами микроорганизмов проводят ряд.5-10 кратных перекрестных пе,ресевов на указанные среды в соответствии со схемой.

Способность чистых культур мик роорганизмов развиваться на всех ,1б предлагаемых средах в течение ряда перекрестных пересевов и осуществлять на соответствующих средах восстановление кислорода, нитратов или сульфатов указывает, что выделенный 5 .штамм обладает полиредуктазными свойствами.

Способ поясняется конкретным. примером.

Пример, Из почвы и шахтных вод местсрождения стерильно отбирают пробы, каждую из которых затем .высевают в 5 пробирок с жидкой срет-. дой Штурм для получения накопительной культуры в анаэробных условиях.

Количество инокулята составляет 5-

10% от общего объема питательной среды. нии среды и появление иона 110 - (о чем судят по порозовению среды при добавлении реактива Грисса), свидетельствует о наличии процессе денит5 рификации.

С колонии íà PIIA делают также посев на агаризованную среду для сульфатредуцирующих микроорганизмов

{среду Штурм) следующего состава дистиллированной воды, г/л:

1253999

Пробирки закрывают резиновыми . пробками так, чтобы в пробирке не осталось пузырьков воздуха и инкубио руют в термостате при 28 С. Через

1О дней, если в пробирке наблюдается почернение среды, обусловленное развитием микроорганизмов, восстанавливающих сульфаты с образованием сероводорода, из полученной наколительной культуры делают высев на ры- 1О бопептонный агар и 5-10 чашек Петри

H культивиро. ание ведут в аэробных условиях .в течение трех суток. В этих условиях происходит гибель всех олигатно-анаэробных микроорганизмов, 15 в частности сульфатредуцирующих бактерий. На чашках Петри обычно вы-. растает небольшое количество колоний, которые выделяют в чистой культуре на скошенньш рыбопептонный агар 2О

Чистые культуры микроорганизмов высевают в 5 пробирок со средой Гильтая для проверки их денитрифицирующей способности и в 5 пробирок в ана- эробные условия ..на агаризованную среду Штурм.

Через 10 дней наличие роста в анаэробных условиях, появление серо30. водорода на среде Штурм, а также обнаружение нитритов в среде Гильтая свдетельствует о выделении микроор, ганизмов — полиредуктантов. В качестве контроля используют среды, не засеянные микроорганизмами. 35

Исследование 50 образцов воды, почвы и руды позволило выделить 4 штамма микроорганизмов, обладающих полиредуктазными свойствами.

Выделенные культуры микроорганизмов были идентифицированы по определению Берги как аэробные формы, относящиеся к семейству Рзецдошоопа

daceae роду Pseudomonas и видам

Ps s tutzeri H Ps endocina. Так как 45 культуры отличались от описанных в определителях Берги и Скермана рядом новых свойств, в частности способностью редуцировать сульфаты, к видивому названию культуры было добав- 50 лено название варианта var. desulfurican

Выделенные микроорганизмы отличались некоторыми культурально-морфо= логическими свойствами и поэтому S5 были разделены на две группы, s одну из которых вошли штаммы 18 и 126-4, а во вторую — 28 и 39в-4.

Описание изученных культур микроорганизмов: Pseudomonas stutzeri var.

desulfuricans 18 — грамотрицательная, подвижная, неспорообразующая палочка, размеры которой 2 " 0,5-0,7 мкм.

На РПЛ колонии вырастают округлой формы, диаметром 5-6 мм коричневого цвета, блестящие, гладкие. Имеют один жгутик. Оптимальное значение рН в пределах 7,2-8,5. Температурный оптимум 25-30"С, но может расти и при

42 С. При 4 С роста нет. На мясопеп-. тонном бульоне образует скудныи осадок, слабо выделяет МЯ и Н Б.

Протеолитической способностью йе обладает, гидролизует крахмал, молоко не пептонизирует и не гидролизует.

Оксидазоположительна. Хемоорганотрофна. Способна расти аэробно на рыбопептонном arape. В качестве источника азота в аэробных условиях используют мочевину, пептон, асларагин.

В качестве единственного источнчка углерода.в азробных условиях использует глюкозу, фруктозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, сахароэу, мальтозу, декстрозу, глицерин, сорбит, маннит, этанол. Иикроаэрофил при росте в аэробных условиях развивается в присутствии органических субстратов, снижающих ОВП среды — мочевины, сульфида натрия.

В анаэробных условиях в качестве энергетического субстрата использует лактат, пируват, ацетат, глюкозу. B присутствии переменновалентных элементов (ИО, Fe ь, As т

S0 ) растет на глюкозе, ацетате, 4 лактате, пирувате. В отсутствии

5+ + ионов N0>, As, Fe — на лактате, 1пирувате, ацетате. Беэ ионов SOq рост не наблюдается.

Способна восстанавливать 0,850,94 мг/мл нитратов до 120 мг/мл сульфатов. Не может осуществлять брожение с образованием газообразных продуктов в анаэробных условиях в присутствии глюкозы. Содержание Г+Ц в ДНК 62,5 мол.7. Десульфовиридин не обнаружен. Выделен из шахтных вод

Бакырчикского месторождения.

Pseudomonas stutzeri var. desulfuricans i26-4 по большинству показателей выделенный штамм сходен с описанным выше Ps. stutzeri var.

desu7furicans 18. Отличительными являются следующие свойства: штамм

126-4 имеет размеры 1,5v0,4-0,6 мкм.

12539

Составитель В.Голимбет

Техред И.Попович Корректор М.Максимишинец

Редактор Ю.Середа

Заказ 4686/28 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж--35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-поли рафическое предприяите, г.ужгород, ул.Проектная, 4

В качестве единственного источника углерода не использует глицерин, декстрозу, сорбит и этанол, Выделен из лечебной грязи озера Балпаш-Сор.

Pseudomonas mendocina var. desuJfuricans 28 — грамположительная, неспорообразующая палочка, имеющая размеры 1х0,4-0,5 мкм. На рыбопептонном агаре колонии вырастают беловатые, гладкие, блестящие, округлой 10 формы. Оптимальное значение рН в пределах 7,2-8,5, температурный оптимум 25-30 С но может расти и при

42 С ° При 4 С роста нет. На мясопептоином бульоне образует плотный 15 обильный осадок, выделяет NH> и Н S, протеолитической способностью не обладает,", гйдролиэует крахмал. Расщепляет жиры, свертывает молоко. Оксидазаотрицательна. Хемоорганотрофна. 20

Способна расти аэробно на рыбопептонном агаре. В качестве источника азота в азробных условиях использу— ет мочевину., пептон, аспарагин. В качестве единственного источника угле- 25 рода в аэробных условиях использует арабинозу, глюкозу, ксилоэу, рамнозу, фруктоэу, галактозу, сахарозу, лактоэу, рафинозу, декстрозу, глицерин, сорбит маннит. При росте в аэробных gg условиях развивается в присутствии органических субстратов, снижающих

ОВП среды — мочевины, пептона, сульфйда натрия.

В аиаэробных условиях в качестве энергетического субстрата использует лактат, пируват, глюкозу, ацетат. Независимо от присутствия н среде ионов переменновалеитных металлов (NO, As, Fe . SG ) хо99 4 рошо растет в анаэробных условиях йа глюкозе, пирувате, ацетате.

Способна восстанавливать 0,870,94 мг/мл нитратов и до 30 мг/л . сульфатов. В среде с глюкозой в анаэробных условиях осуществляет брожение с образованием газообразных продуктов. Содержанке Г+Ц в ДНК 51,7

51,7 мол.X. Десульфовиридин не обнаружен. Выделен иэ шахтных вод Бакырчикского месторождения Pseudomonas

mendocina var. аеас furicans 39 в-4ло большинству признаков выделенная культура микроорганизмов также сходна с Ps. mendocina var. desulfuricans 28. Но имеются следующие отли" . чительные признаки. Штамм 39в-4 имеет размеры клеток 1 0,3-0,4 мкм. В качестве единственного источника углерода использует мальтоэу, дульцит и глицерин. Штамм 39в-4 обладает слабой протеолитической активностью и слабо разжижает желатин.

Выделен из воды канала ИртышКараганда.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выделить в течение

25-30 дней представителей новой группы микроорганизмов, способных в анаэробных условиях восстанавливать ряд переменно валентных элементов и расти в аэробных условиях, в то время как, используя общепринятые методы, поиск микроорганизмов — полиредуктактов по проверке всех выросших на РПА колоний микроорганизмов к способности к полире-„„ дукции, может занять неопределенно долгое время.