Способ определения стероидных гормонов в биологических объектах

Способ определения стероидных гормонов в биологических объектах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии , в частности к способам определения стероидных гормонов. Цель изобретения -. повьппение точности, чувствительности , специфичности способа, а также возможность одновременного определения в пробе нескольких стимуляторов роста группы андрогенов. Образцы тканей животных гомогенизируют в смесителе с пятикратным объемом 0,14 М раствора NaCl. Затем в гомогенат добавляют 2,5 объема смеси растворителей: эфир - метилеихлорид

СОЮЗ СаВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУ БЛИН др а G О1 N 33/74

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ!9 (21) 3779162/28-14 (22) 31 07.84 (46) 30.11.86. Бюл. В 44 (72) Л.Ф.Адигамов (53) 616.07(088.8) (56) Ficat P. Arlet J Coxopathies

inchemiques. Rev.Chir.0rthop. 1972.

58, 6, 543-561. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОЙДНЫХ

ГОРМОНОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЬЕКТАХ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения стерондных гормонов. Цель изобретения — повышение точности, чувствительности, специфичности способа, а также возможность одновременного

Э определения в пробе нескольких сти- муляторов роста группы андрогеков. .Образцы тканей животных гомогенизируют в смесителе с пятикратным объемом 0,14 М раствора NaC1. Затем в гомогенат добавляют 2,5 объема смеси растворителей: эфир — метиленхлорид (1:1) и встряхивают в течение

I ч. Зкстракцию повторяют равным объемом экстрагента в течение 30мик.

Органическую фазу переносят в колбу, фильтруют через безводный Яв $0 и выпаривают на роторном испарктеле

„.SU„„1273334 А I при 40 С. Концентрированный экстракт растворяют в хлороформе и наносят на колонку силикагеля (200 меш): фракция 9 1-- 18 мл хлороформа (не содержит исследуемые стероиды),фракция Ф 230 мл 0,5Х-ного метанола в хлороформе - содержит малополярные стероиды (метилтестостерон-стероид

l.l.l, l9-нортестостерон - стероид l. 1.5, трекболон-стероид 1. !.6, 4 -андроствдиен-17Рол-3-он-стероид l.!.7, 17о(-метил-5 А-дигидротестостерон — стероид !.1,9), фракция:

ll, 3 — 25 мл 15Х-ного метанола в хлороформе - содержит полярные стеронды (1.1.8 стероид-11 8 -оксиметипте- 3 стостерон, !.1.11 стероид- Д -внд1,4 ростадиен-17ф -оп-3-îí, I.f.!0 сте- И рокд-6Р "оксиметвндростенолон). Определяют малополярные и полярные стерокды. Полученный на конечной стадии очистки сухой остаток растворяют в 96Х-ном этвноле, добавляют реагент: 96%-ном этанол — концентрированкая Н 80 (l:9). Смесь пере4 меаиввют, прогревают, охлаждают и добавляют этвнол. Смесь еще переие- М кивают и измеряют флюоресценцию при 44

-а 520 нм, Р возбуждения 480 нм. ф;!

1 ил, 1 табл. 4:ь

12

Изобретение Относится к биохи. мии, в час" íîñòè к способам определения стероидных гормонов.

Цель изобретения — повыше»ие точ-. ности, чу)зствительности, специфичности способа, а также возможность одновременного определепия н пробе нескОльких стимулятарОв роста Группы андрагенов .

Способ асу1цестгля)от следую)цим образам.

3 — 10 г образца съедобных тканей сельскохозяйственных животных (мь)шц, печени или почек) гамогенизируют в смесителе с пятикратнь)м объемом

0,14 11 раствора 1)аС1. Гомогенат переносят в плоскодонную колбу, добавля<<)т ",, 5 ()е:.- -" с"-(Оси растворителей: эфир-1-><2 1>tt/J, (>:1) и встрнхи-13ают 1 ч в а>.1}1>)1 > е;1 JIT встряхиваktkt JT, 133<<: Тiirl) . ":, -!} Ttr>33 J t)Pkt) T PBTI!>T>321 объемм>я . »ra в теченп 30 мин.

Орг) 11)ческу)<} фазу (пос.,.<е о Tстаива»11)«";.<>1> <-11 - ". ::> «> <1 r>):1:.. Ъ ) <З ТС аСЬ)}За)<ЗТ

2!Op Q) КОЕ JT> О >1 О> t < 1 })<>13)Ее)З< /3)Л<3 ?????? ??)>ДА Tip}1(inî « 3J>r J> 3 t! I < 1> 11е) Q "> >I< > IT) >1>ИЯ жил),остей >, }>ð>зk>if<; Jrт r, r(<3/>F>у, <3)иль < р>/)О ) Ч>>., ) г Э I; - > I-;ОД\>ЫЕ: > ir! 81 > )i Е>3 1» а})И

<>

Бают 331 . )):: т<)»:;; и()2<3,})1)з е}е при 40 С.

Ск»)",: r.: r! r >»rз» *,;; н)<ый: 1;<.трл)> -< р яc 1 ° . вr<) Е Т3 2 1>)<1 ;.>;i J>-, »<å!"> <>,3> J >r- . 3(tt()p,>" фо}ЗЕ,"а }.3 «1 r,IT) TT нct!To< Я 3 LB >(/

cnTt ; >;)> "1(1)я Е,> I! : 311 ->Я > ., Tr<<" 1><(>)3„ -» УЕ>З ° )FO

Л>Э))1< 1> 01 */ З /, )! Ot>J „3>IT(>IT;21) )Jpor)<Здя 1 С(З с><о<)ас-1 } О, /:.,(32/>)ин, > ; ">е(ци}1

1 8 ил л/1<1>)з<)ф<зрма — ие < Одержи 1 и<. ("ле д)>1 мы; с 3 F! ИО)Е» >3,>gqr

01 3,>" »<)ГО JP/TBkto.ttа» ";T:>ро<1 >О<эме

:, е>... >1.

1 О)1<еР)Р >! ""; ;»1 ., Л;2< 333>\ <1311 <??, 3 1??><»!1 < t Р )3> 3><Д ), i е 1, 1 9""

-н<зртеста::т< ))(331 — ст(1>оид 1 . ), 5. тре<п>(111(311 - <. j r T><>><1<,, ) . )3 а ° 1 -а><д=, ре><" ) а/11>1. 1:,-. \ /" - С>}Е-. r -О>3 - (»2<-ро<П> . 7 1 1,-/ . 3;rr:J» IJ — "> > - » ЕЕ->11>-1О 1 е> т<><„> с < et)i)t ст< I)<3)t, 2 ) ° 1 . " > <)3 зэк>1ия 3

25 3>3>3 1 3/, - ! О >,l(1 Е <)<НО/Еа В ХЛОр<афа}1".

МЕ ". СОГЗ< T!33 (>. е 1 8 ст":)3<3>>д "" ) 1 /ез " Оксиметпл

) .3 . Тестостеро)е. 1.>,1, 1 е сте1з<зи/} -Ь

-a31/3pocr3:а/»<3; .}з<зи/з,-<) f) — Оксиметаидраст<332vnokt) .

<1)paT(1Tt<1O 2 (ПОСЛЕ Храня.}ео) }Зяфк)1 н а 1(<З л О> 3)к е C H:31) 1(а Г «) <я ) в ып аp kt)3 Gt(t r B ваl(ууме ЦО миннмаль»ОГО объема и

»аносят на пластину флоризила. 1)рименяют флоризил с флюоресцентным индикатором r!pv. /3 = 254»м (ппастины

20х20 см, толщ»яа слоя О, б ми) . Тон13334 2 кослойную хроматографию проводят двукратно в системах растворителей: хлороформ — этанол — бензол (85:5:15) и гексан — дихлорэтанзтилацетат (50;20:20), Локализацию стероидов устанавливают облучением пластины в

УФ-свете и по Rf стандартов. Участки слон силикагеля, соответствую» tJTkte исследуемым стероидам, снимают с пластины, переносят в плоскодонные колбочки и элюируют дважды (па 30 мин) 10 мл 9б -ного зтанола на )лагнитной мешалке, Зтанольные растворы после двукратной элюции объединяют, выпаривают досуха и ис— пользуют для количественного определения стероидов флюорометрическим или ГБХ методом, Фракцию 3, полученную после хроматографии.на колонке силикагеля и содержащую поляр))ые стеро))дь), выпаривак)т до минимального объема и наносят lta пластину окиси алюминия (3Tt)33kJe«JTI)т Л1 0 с <Ьл)ооресцентнь)м

9 3

25 индикатором при =- 254 нм, плас- тины 20х20 см, то)щина слоя 0,5 мм).

ТСХ проводят двукратно в системах

> растворителеи: хлороформ — этилацетат (1." I ) и бензол — зтаиол (9,5: щ ".0,5).

11редлагаемые условия ТСХ на Al С и 3 позволяют эффективно разделить исследуемые пол))рные стероиды. Локализацию стероидов tta пластине определяют и их элюцию проводят как

Описано для малополярных стероидов. ,Па))нь)м методом определяют мало»}олярные и полярные стероиды (кроме (3} 1 -андрастадиен-1i P -ол-3"он, который следует определять ГИХ-)яетадам). Полученный »а кo.)ечной стадии Очистки сухой Остаток, соответY)3лое1)1.1е е одному из исследуемых сте})(з)щов, растворяют н 0,3 мл 9б%- . ного =-такала и добавляют 1 5 мл реаге))та: 9б%-3)ый зтанол — концентрированная серная кислота (1:9). Смесь перемешивают, лрагревают 8 мин при

r>

80, охз)а))<дают на ледяной бане и

r}g добавляют 1 м<л этанола. Смесь тща"

>ель»о пере)<е)е)ива)ат и через 20 мин (выдерживают в темноте при комнатной температуре) измеряют флюоресценцию при <} = 520 нмP - =480 нм. Вега сйаи <}.

53 ГЖХ (з;еект}1<311нь)Й захват) метод

- количественного измерения.

Метод может быть использован для количественного измерения малопаляр12733"4 з ных стероидон. Для получения фторпроиэводных сухой остаток, соответ" стнующий каждому из исследуемых стероидов, растворяют и 0,5 мл бенэола и добавляют 2-3 капли гептафтормасляного ангидрида. Смесь про о гревают 50 мин при 70 и высушивают под струей азота. При фторирова нии от каждого из исследуемых стероидов получают 3- или 17-монофтор производные и 3,17-дигептафторбути .раты. ГЖХ-анализ фторпроизводных стероидов проводят с использование в качестве жидкой фазы ЗЖ OV-1, на несенной на хроматон ))-М)-DHCS, пр меняют стеклянные колонки размером.

1,5 м, температура колонки 200, ис парителя 240, детектора 250 C, ras носитель — азот 40 мл/мин. Типичны результаты I" ÊÕ-av;vre a на примере фторпроиэводных S 4 -андростадиен! (4

-) 7P -ол-3-он приведены на чертеже

ГЖХ (электронный захват)-анализ ст роидов позволяет выявить 0,0002 вещества в пробе. ф

Суьп4арное содержание биологически

Образцы тканей бычков активных стероидов

1 мкг/кг ткани

Пример 1, Опыт проведен на откормочных бычках черно-пестрой породы в возрасте одного года, выра1 щенных в условиях промьппленного комплекса. Животные получали корм

)вволю. б7Е питательности рациона составляли концентрированные корма .и 337. сенаж. Животным подкожно н область корня уха имплантиронали

1,1 ! 7о -метил- а -андростадиен-) 7P—

"ол-3-он (метандростенолои) в дозах

130 и 70 мг эа 1 и 2 мес до забоя.

После убоя животных проводили гигиенический анализ мяса и субпродуктов с применением предлагаемого метода определения остаточных коли. честв биологически активных стерои-. дов андростаноного ряда. Аналогичные исследования стероидов проводили в сыворотке крови испытуемых животных, .полученной в разные сроки после имплантации препарата.

В биопробах тканей (мясо, печень, жировая ткань) и сыворотки крови выявлены следующие биологически а ""ивные стероиды: 17 -метил-61-анд» ростен-)7ф-oл-3-он, )Ы-метил-5d.-адростан-178 -ол-3-он; I Ъ),-метил- Ь " -андростадиен-бф, 17 -диол-3 f

-он, 17о).-метил-h -андростан-)7P-олг)"

-3-он. Суммарное их содержание приведено ниже.

Печень 13,8 .

То же 10,8

Печень 7,4

То же 12,8

0 0

Мьппцы 0,0

То же 4,2

5,3 м

II

3,7

0 0

Р и- 1Я

Пщщеденные величины биологически активных стероидов группь| андро-. генов в продуктах жинотнонодства, полученных н условиях стимуляции е бычков 130 мг метандростенолона, превышают принятые в нашей стране и за рубежом гигиецические регламенты содержания соединений данной группы. еВместе с тем, при имплантации бычкам метандростенолона н дозе 70 мг остаточные количества биологически активных стероидов в продуктах животноводства были существенно ниже.

Пример 2. Баранчикам под30 кожно в область корня уха был имплантнрован меченый препарат н дозе

50 мг. Биопробы тканей и биологических жидкостей были получены через ),2 и 3 мес после имплантации.

Кроме того, поставлен допопнительный эксперимент на собаках по введению меченого метандростенолона.

В биопробах от животных (печени, мьппц, слизистой кишечника биологищ ческих жидкостей) выявлены следующие биологически активные стероидные соединения группы андрогенов:

Я

17 -метил-6 -андростен-)7P-ол-З-он, 1 7а -метил-Ы-андростан-1 7р-ол-3-он, l7aL-метил- Ь "-андростадиен-6/3,1/р-диол-З-îí, 17о -метил-б4-андростен-i )p I 17p-диол-3-он.

Суммарное содержание названных стероидов в образцах от баранчиков, у стимулированных в течение месяца, составляли в среднеи 13,4 мкг/кг (печень) 4,6 мкг/кг (мьппцы),, 2,8 мкг/кг (слизистая кишечника).

Приведенные величины содержания стеу роидов в печени превышают допустимые уровни содержания биологически актив ных андрогенов в продуктах животно водства. Вместе с тем по сравнению

Биопроба

Сроки после имплантации

Он жено

Не обнаружено следов жено

0,40 То же

Печень 0,25

0,36

0,28

Почки

Ь 12 с приведенными данными остаточные количества стероидов н печени животных, стимулированных в течение 2 и 3 мес были соотнетственно н 1,5и 2 раза ниже. В ткани мьппц через

2-3,мес после имплантации стероиды выявлены не были °

Пример 3. Проведены опыты на 2 кроликах, которым был имплантирован д андростадиен-ол-17Р-он-3 (по 10 мг препарата).

-Убой животных проводили через

20 и 40 дней после имплантации. Исследование остаточных количеств препарата проводился в тканях печени, почек, иьппц„ жире, биологических жидкостях. В этих опытах исследовано также влияние препарата на гормональный статус животных.

В таблице прнведень» остаточные количества биологически активных стероидов в съедобных тканях животных.

Как показано в таблице, остаточные количества биологически активных стероидов выявлены лишь через 20 дней после имплантация. Через 40

1 дней исследуемые соединения в съедобных тканях обнаружены не были. Уровни тестостерона, прогестерона, ll—

-оксикортикостерондов, альдостерона, тироксина, инсулина н сыворотке крови до имплантации и через

40 дней после имплантации существенно не отличались. Полученные данные соответствуют гигиеническим требованиям и регламентам.,Формула изобретения

Способ определения стероидных гормонов в биологических обьектах, 73334 Ь вклчающий зкстракцию и биохимический анализ стимуляторов роста группы андрогенон, о т л и ч а ю щ н йс я тем, что, с целью повьппения

5 точности чувствительности и специ» фичности способа, а также одновременного анализа в них метилтестосте. рона, 19-нортестостерона, тренболона, р,14 -андрцатадиен-l7P-ол-3-она, 111З-оксиметилМстостерона, 6 -оксиметандростенолона, ь -андростади1,1 ен-11 Р, 17Р-диол-3-она, 178--метил-5g-дигидротестостерона, водный гомогенат биоматериала экстрагируют смесью эфир, метипенхлорид в соотношении 1;,1, экстракт наносят на колонку силикагеля, промывают хлоро-. формом, далее через колонку пропус.кают 0,5К-ный раствор метанола н хлороформе. и собирают фракцию малополярных стероидов, затем колонку элюируют 157-ным раствором метанола в хлороформе и собирают фракцию полярных стероидов, далее фракцию

25 мвлополярйых стероидов разделяют с помощью метода тонкослойной хроматографии на флоризеле, при этом йдентифицируют 19-нортестостерои, тренболон, Р -андростадиен-17 -олЗО -3-он метилтестостерон и 17о -метил- о1-дигндротестостерон, а фракцию полярных стероидов разделяют метрдом тонкослойной хроматографии на окиси алюминия, при этом идентифицируют ll P-оксиметилтестостерон, 3.»

6)-оксиметандростенолон, g -андро1,.1 стадиен-11Р» 1719-диол-3-он, а коли чественное определение каждого нз гормонов проводят флюориметрически или с помощью метода электроннозахватной газожидкостной хроматографии.

Составитель А.Скоролод

Редактор Т. Иитенко Техред АЯравчук Корректор И.Куска

«

Заказ 6384/17 Тирам 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного конитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, %-35, Рауиская наб. ° д. 4/5

Производственно-полигра4нческое предприятие, г. Умгород, .1и. Проектная, 4