Вектор для клонирования генов,обеспечивающий регулируемую транскрипцию чужеродных генов,и способ его конструирования

Вектор для клонирования генов,обеспечивающий регулируемую транскрипцию чужеродных генов,и способ его конструирования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. Вектор для клонирования генов , обеспечивающий регулируемую транскрипцию чужеродных генов, состоит из Ват HI - Есо RI-фрагмента плазмидной ДНК pBR 322 и Ват Hi Есо RI-фрагмента ДНК регуляторной области фага/ , имеет мол. массу 5,3мегадальтона , по одному сайту рестрикции эндонуклеаз рестрикции Ват HI, Есо RI, SaE I, Нра I, по два сайта эндонуклеаз рестрикции Pst I и Hind III, два промотора Р « Р , сайты Ваш HI и Sa I удалены от Р -промотора на 0,7 и 0,9 мегадальтона соответственно , сайт Есо RI отстоит на 0,7 мегадальтона от Р -промотора и на 3,1 мегадальтона от Р -промотора, ori - репликон плазмиды Со EI, термочувствительный репрессор с I 857, гены фага Д с II, его (атб), с I, rex, N, селективные маркеры расстоянии 2 мегадальтона от Ват HIсайта и АР на расстоянии 3,5 мегадальтона от Ват Н1-сайта, хозяин вектора - Escherichia coEi. 2. Способ конструирования вектора для клонирования генов, включающий гидролиз донорной и реципиентной ДНК эндонуклеазами рестрикции, соединение образовавщихся фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидлигазы, трансформацию клеток Escherichia смесью полученных гибридных ДНК, отбор клонов. Содержащих гибридные плазмиды , выделение вектора для клонироваi ния, отличающийся тем, что, с целью получения вектора с меньсл шей молекулярной массой, обеспечивающего peгyлиpye гyю транскрипцию чужеродных генов, в качестве реципиентной ДНК используют ДНК плазмиды pBR 322, в качестве донорной ДНК - ДНК фагаД с1 857 его 6, а гидролизу подвергают ND СЛ смесь донорной и реципиентной ДНК, из эндонуклеаз рестрикции используют эндонуклеазы Ват HI и Есо RI, О при этом последние вносят в реакциNU онную смесь одновременно, отбор клооо нов, содержащих гидридные гшазмиды, проводят на среде с ампициллином в присутствии фагов / с1 и h 434 imm/ cl, причем из клеток вьщеляют вектор для клонироваш-ш, содерх ащ1сй ДНК регуляторной области фага А , включающей ранние промоторы фага , и гены репрессоров с мутациями с1 857 и его am 6.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„sU„„ > (5D 4 С 12 М 15/00, С 12 R 1:19

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ Фр -. т

Ъ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ l -, Яю

1 г

- -. с !

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 2664904/30-15 (22) 13.09.78 (46) 07.12.86. Бюл. Р 45 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (72) А.С. Солонин, В.И. Таняшин, Л.M. Семенова и А.А. Баев (53) 576.8(088.8) (56) Заявка франции 11- 2281426, кл. С 12 К 3/00, опублик. 1976.

Hekinski D.R. et a3 in. Recombinant MoIecukes. — Raven. Press, Иеъ

York, 1977, р. 151. (54) ВЕКТОР ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ, ОБЕСПЕЧИВА10ЩИЙ РЕГУЛИРУЕ11УИ ТРАНСКРИПЦИ10 ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ, И СПОСОБ

ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) 1. Вектор для клонирования генов, обеспечивающий регулируемую транскрипцию чужеродных генов, СоСтоит из Bam HI — Есо RI-фрагмента плазмидной ДНК pBR 322 и Ватп Hi

Есо RI-фрагмента ДНК регуляторной области фага, имеет мол. массу 5,3ме— гадальтона, по одному сайту рестрикции эндонуклеаз рестрикции Bam HI„

Есо RI, SaL I, Нра I, по два сайта эндонуклеаз рестрикции Pst I u Hind

III, два промотора P u P сайты

Bam HI u Бат I удалены от P -промо1 тора на 0,7 и 0,9 мегадальтона соответственно, сайт Fco RI отстоит на

0 7 мегадальтона от P -промотора и

У

R на 3, 1 мегадальтона от Є— промотора, ori — репликон плазмиды Со1 EI, тер— мочувствительный репрессор с I 857, гены фага A с II, cro (am6), с I, rex, N, селективные маркеры h на расстоянии 2 мегадальтона от Bam HI2 сайта и АР на расстоянии 3,5 мегадальтона от Bam HI-сайта, хозяин век— тора — Escherichia со3i

2. Способ констр трования вектора для клонирования генов, включающий гидролиз донорной и реципиентной ДНК эндонуклеазами рестрикции, соединение образовавшихся фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидлигазы, трансформацию клеток Escherichia cori смесью полученных гибридных ДНК, отбор клонов, содержащих гибридные плазмиды, выделение вектора для клонирова— ния, отлич aþùèéся тем, что, с целью получения вектора с меньшей молекулярной массой, обеспечива— ющего регулируемую транскрипцию чуже- С родных генов, в качестве реципиентной

ДНК используют ДНК плазмиды pBR 322, в качестве донорной ДНК вЂ” ДНК фага h p a

cI 857 cro 6, а гидролизу подвергают смесь донорной и реципиентной ДНК, из эндонуклеаз рестрикции используют эндонуклеазы Ватп HI u Eco RI, при этом последние вносят в реакционную смесь одновременно, отбор клонов, содержацих гидридные плазмиды, проводят на среде с ампициллином в присутствии фагов 3 cI u h 434 imm P с1, причем из клеток выделяют вектор для клонироватьтя, содержащий ДНК регуляторной области фага ., включаю— щей ранние промоторы фага,1 и гены

Л репрессоров с мутациями cI 857 и

cro am 6.

1 12

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к вектору для клонирования генов, обеспечиваю— щему регулируемую, транскрипцию чужеродных генов, и способу его конструирования.

Целью изобретения является получение вектора с небольшой молекуляр— ной массой, обеспечивающего регулируемую транскрипцию чужеродных генов.

На фиг. 1 представлено электрофо— ретическое разделение фрагментов ДНК при гидролизе различными эндонуклеа— зами рестрикции; на фиг. 2 — схема плазмид 202 (cI cro ) и 203 (cI 857

cro 6) с точкой рестрикции и генетической картой; на фиг. 3 — кинети 2 > ка связывания репрессора с Р ДНК фаг а ll cI при различных температурах; на фиг. 4 — связывание репрессора с Р ДНК фага P cI при различных тем—

32 пературах; на фиг. 5 — схема гибридных плазмид; на фиг. 6 — кривая рос— т а культур, содержащих различные плазмиды при 30 С и при перенесении культур на 43 С.

Вектор для клонирования, обеспечивающий регулируемую транскрипцию чужеродных генов, состоит из Bam HIEco RI — фрагмента плазмидной ДНК pBR

322 и Ваш HI — Есо RI — фрагмента ДНК регуляторной области фага A и имеет мол. массу 5,3 мегадальтона, по одному сайту рестрикции эндонуклеаз рестрикции Bam HI, Есо RI, SaР I, Нра I, по два сайта эндонуклеаз рест— рикции Pst I u Hind III, два промотора P и Р, сайты Bam HI u БаР

L удалены от Р -промотора на 0,7 и

0,9 мегадальтона соответственно, сайт

Есо RI отстоит на 0,7 мегадальтон от

Р -промотора и на 3,! мегадальтона от Р„ — промотора, ori — репликон плазмиды Cot EI, термочувствительный репрессор cI 857, гены фага /, cII, cro (am 6), cI, rex, N, селективные маркеры ) "" на расстоянии 2 мегадальто— на, от Bam HI — сайта и Ар на расстоя—

1 нии 3,5 мегадальтона от Bam HI-сайта, хозяин вектора — Escherichia cori

Пример. Получение плазмидной

ДНК р BR 322.

Клетки, содержащие плазмиду

pBR 322, выращивают в 500 мл бу— льона до плотности 0,6 (5 10 клеток

8 на 1 мл), добавляют в культуральную среду хлорамфеникол до конечной концентрации 200 мкг/1 мл и продолжают

75043

55 культивирование в течение 12 ч. 3атем клетки собирают центрифугирова— нием (5000 об/мин, 20 мин), промывают равным объемом буфера (50 MM тРис — НС Р, рН 8,0), суспендируют в

4 мл 20 †н сахарозы в 50 мМ тРис.НС 1, рН 8,0, добавляют 1,2 мл лизо— цима (5 мг/мл) и инкубируют 10 мин во льду при аккуратном помешивании.

К смеси добавляют 2„4 мл 0,25 М ЭДТА рН 8,0, оставляют во льду на 10 мин, а затем добавляют последовательно

2,6 мл 5M NaCf. и 1,2 мл 10Х-ного додецилсуЪтьфата натрия, инкубируют во льду в течение 5 — 7 ч. Осветленные лизаты получают центрифугированием при

16000 об/мин в течение 1 ч. К экстрактам добавляют CsCI. из расчета

1,7 г/мл и бромид этидия до конечной концентрации 200 мкг/мл. Полученную смесь центрифугируют при 44000 об/

/мин в течение 24 — 48 ч. Нижнюю, про— крашенную бромистым этидием, зону собирают по каплям, прокалывая про— бирку под зоной. Полученную ДНК диализуют против 10 мМ теис — НСР, рН 8,0 мМ ЭДТА, 10 мМ НаСР.

Получение ДНК фага 1 . Культуру

Е. соР1. С600 (1 с1857 cro 6) выращи— вают до плотности 0,4 при 30 С, рез— ко прогревают на газовой горелке до

42 С и инкубируют при этой температу— ре в течение 15 мин, затем инкубиру— ют при 37 С в течение 2 ч при интенсивной аэрации, добавляют 0,01 обь— ема хлороформа и через 10 мин лизаты освобождают от клеточных обломков центрифугированием. Фаг очищают тре— мя циклами дифференциального центрифугирования (20000 об/мин 3 ч, 6000 об/мин) и репротеинизируют во— донасыщенным фенолом при рН 8,0 (50 мМ сисис -НСE) дважды. Полученную

ДНК фага диализуют против 10 мМ трис. — НС Р, 1 мМ ЭДТА, 1М NaC F трижды и окончательно тремя сменами 10 мМ тгис НС I, рН 8, О, 1 мМ ЭДТА при 20кратном разведении.

Рестрикция ДНК. Плазмидную (pBR

322) и фаговую (1 cI 857 cro 6) ДНК для рестрикции смешивают в соотношении 1:5 и одновременно добавляют эндонуклеазы рестрикции Есо RI и Ваш HI по 0,2 мкл на каждый мкг смешенной

ДНК. Инкубацию проводят в 50 мМтгис

НСР, рН 7,5, 10 мМ МССР, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитоле (буфер А) в течение 1 ч при 37 С, а затем смесь з 1275 прогревают до 70 С в течение 10 мин.

Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза в 0,8X — ной агарозе в тгис -боратном буфере, рН 8,3.

Лигирование ДНК. Смешивают 225 мкл растворов фрагментов ДНК, полученных при гидролизе эндонуклеазами рестрикции (10 мкг), с 25 мкл 5 мМ АТФ и

2 мкл полинуклеотидлигазы (3000 ед/

/мл). Смесь инкубируют при 10 С в те-10 чение 6 ч, при 10-кратном разведении добавляют инкубационный буфер А, АТФ (конечная концентрация 0,5 мМ) и по— линуклеотидлигазу из расчета 1 мкл фермента на 10 мгк ДНК. Продолжают и 15 инкубацию при 0 С в течение 2 суток.

Полученную смесь используют для трансформации.

Трансформация рекомбинантной плаз— мидной ДНК бактериальных клеток. 20

25 мл бульона заражают 0,1 мл ночной культуры Е. co(i и выращивают до плотности 0,6. После 10 мин охлаждения клетки собирают центрифугированием и суспендируют в равном объеме

0,1 M MgSO . Полученную суспензию охлаждают 20 мин, клетки собирают центрифугированием и суспендируют в

0,5 объема 0,1 M СаС . Суспензию клеток охлаждают в течение 20 мин, . 30 клетки осаждают центрифугированием и суспендируют в 1/50 исходного объема

0,1 M CaCE . После дополнительного

2 охлаждения (30 мин) клетки используют для трансформации. 35

ДНК, предназначенную для трансформации, диализуют против 0,05 M СаС 1 с 10 мМ тгис -НС2, рН 7,5, смешивают с равным объемом СаС1 -клеток и ох— лаждают в течение 20 мин. Затем смесь40 подвергают 1 мин термической обработке при 42 С, выдерживают в течение о

15 мин при 20 С и охлаждают в течение 20 мин. Эту смесь после десятикратного разбавления бульоном и под- 45 ращивания клеток при 30 С в течение

30 мин, наносят на чашки Петри с ампициллином (20 мкг/мл) и с фагами и Л h 434 imm Д (1"10 каждого мо фага на чашку) ° 50

Анализ функционирования генов в гибридной плазмиде. Выросшие на твердой среде с ампициллином и в присутствии фагов колонии культивируют с

1 мл бульона в течение 5 ч при 30 С, 55

0,1 мл культуры высевают в мягком агаре на чашки с МПА, содержащим

20 мкг/мл ампициллина. На мягкий

043 агар накапывают различные суспензии фагов от 1. 10 до 1. 10 фаговых час5 6 тиц в капле

Результаты анализа представлены в табл. 1, знаком + отмечены фаги, способные размножаться на анализируемой культуре.

Резистентность отобранньгх клонов к антибиотикам анализируют на агаризованной среде с антибиотиками ампициллином (20 мкг/мл) и тетрациклином (20 МК1 /мл). При введении фрагмента

ДНК фага в плазмнду между сайтами

Есо Rl и Ваш HI структурный ген, отвечающий за устойчивость клеток к т етр ациклину, нарушается (табл . 1, резистентные к антибиотикам клоны отмечены знаком +). Отбирают пять клонов, резистентных к ампициллину, к фагу 8 cI и нечувствительные к rII мутантам фага Т4.

Выделение плазмид ускоренным методом. В связи с необходимостью одно— временного анализа физической структуры плазмидных ДНК, выделенных из различных клонов, выделяют плазмиды ускоренным методом, который состоит в следующем.

Культуру выращивают в 10 мл бульона, осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в 1 мл 25ь-ной сахарозы в 20 мМ т ис -НС1 рН 8,0, добавляют 0,2 мл лизоцима (5 мг/мл) и 50мкл

ЭДТА (0,25 М) . После инкубации при осторожном перемешивании в течение

10 мин во льду добавляют 50 мкл пан— креатической РНКазы (1 мг/мл), предварительно прогретой при 100 С в течение 5 мин, и 0,5 мл "лизирующей" смеси (0,3 мл 10Е тритон-Х-100, 7,5 мл

M ЭДТА рН 8,0, 1,5 мл 1 М ттис — НС E рН 8,0, 0,7 мл Н О) . После инкубации

2 при постоянном помешивании стеклянной палочкой во льду в течение 10 мин получают осветленный лизат центрифугированием пробы в течение 1 ч при

17000 об/мин (К-24 Janetski). Полученный лизат разбавляют водой вдвое, обрабатывают равным объемом фенола, насыщенного 50 мМ тРис -НС1, рН 8,0, при комнатной температуре в течение

10 мин, водную фазу собирают центрифугированием при 6000 об/мнн. Остав— шийся в пробе фенол удаляют эфирной экстракцией, а ДНК переосаждают 707.— ным спиртом.

5 1275

Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмидных ДНК. Для изучения физической структуры ДНК и идентификации введенного фрагмента регулятор— ной области фага h плазмидную ДНК обрабатывают эндонуклеазами рестрикции

Есо RI Ватп HI, SaI I, Pst I,, Hind

III, Pha I u Bgf. II.

К 0,5 мкг ДНК в буфере, содержащем 50 мМ трис -НС1, рН 7,5, 10 MN 1О

М@С1, 10 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА, добавляют 0,1-5 мкл эндонуклеазы рестрикции.

Общий объем реакционной смеси колеблется между 10 и 40 мкл при обработ— ках различными рестриктазами. При 15 совместном гидролизе оба фермента добавляют к реакционной смеси и инкубируют одновременно. Продопжительность инкубации изменяется в зависимости от активности эндонуклеаз от 30 мин 20 до 3 ч. Для всех эндонуклеаз рестрикции инкубацию проводят при 37 С, кро— ме гидролиза плазмидной ДНК Pst I, который ведут при 30 С. Гидролизаты анализируют с помощью электрофореза реакционной смеси в 0,8Х-ном агароз— ном пластинчатом геле в трис -боратном буфере рН 8,3.

Результаты рестрикционного анализа представлены на фиг. 1 и. 2. 30

Основываясь на известном расположении промоторов фага и данных рест— рикционноro анализа, можно заклю— чить, что сайты Ватп HI u Saf I удалены от Р„ -промотора на 0,7 и 0,9 ме— гадальтона соответственно. Сайт эндонуклеазы рестрикции Есо RI отсто— ит на 0,7 и 3,1 мегадальтона соответственно от P u P . Эти расстояния и можно считать достаточно небольшими, 10 так как транскрипция, начинаясь в области иммунности, продолжается влево до поздних генов фага (ЗОБ фаговой

ДНК или около 10 мегадальтон) и впра— во до гена 0 (около 5 мегадальтон) .

Анализ синтеза репрессора в клетках, содержащих плазмиды. Количество репрессора в клеточных экстрактах оп— ределяют по методу Эхолса и Грин, которьп основан на анализе количества меченой фаговой ДНК, связываемой с репрессором и не задерживаемой на нитроцеллюлозных фильтрах. Этот ме— тод использован для изучения кинетики связывания репрессора, выделенно- 5g го из различных клонов, а также для изучения уровня его связывания с ДНК при различных температурах.

043 а

На фиг. 3 показано, что кинетика связывания репрессора, выделенного из клеток с гибридными плазмидами, содержащими cI дикого типа, сущест— венно не зависит от температуры, тогда как связывание термочувствитель— ного репрессора, синтезированного в клетках с плазмидами, несущими му— тантную регуляторную область фага, заметно ухудшается при незначительном изменении температуры инкубации.

Уровень связывания репрессора при

22 С не зависит от наличия мутации и при нят за 1007..

На фиг. 4 показано, что степень связывания термочувствительного репрессора с ДНК быстрее уменьшается при увеличении температуры, чем репрессора дикого типа.

Генетический анализ регуляторной области фага введенной в рекомбинантную плазмидную ДНК. Для доказа— тельства одновременного присутствия мутаций в генах cI u cro проводят рекомбинацию in vivo между плазмидами и фагом h i 434 с, который дает на бактериальном газоне бляшки с мутным центром за счет эффективной лизоге— низации. Штаммы, содержащие плазмид— ную ДНК, выращивают в 10 мл бульона до плотности 0,2 (1,6 ° 10 клеток/мл)

8 при 30 С, инфицируют фагом / . 434 с множественностью 0,1, инкубируют при

30 C в течение 4 ч, добавляют 1/100 объема хлороформа и оттитровывают на бактериальном газоне, содержащем и не содержащем профаг 434. Наличие рекомбинантов дополнительно указывает на присутствие регуляторной области фага cI в гибридных плазмидах. Час— тоту рекомбинации анализируют сравнением титра фагов на этих двух культурах при 37 С.

Результаты опытов сведены в табл.3.

Частоты рекомбинации соответству— ют теоретически рассчитанному значению и строго зависят от величины введенного в плазмиду фагового фрагмен— та. Кроме того, показано, что часто— та рекомбинации не зависит от гена

rec А Е. соfi Гибридный фаг, полу— ченный при рекомбинации с плазмидами клонов 203, 237, 252, образует на газоне клеток Е. coli С 600 при 37 С о прозрачные бляшки, а при 30 — мутные, что указывает на наличие термочувствительной мутации в гене cI, тогда как рекомбинанты с плазмидами

7 12750

202, 301 и 537 при 37 С образуют мутные бляшки. Анализ наличия в гибридных фагах супрессируемой мутации в гене cro проводят сравнением эффективности титрования этих фагов на штаммах Е. cori с различными супрес— сорными т-PHK при 30, 38 и 43 С.

Результаты анализа, сведенные в табл. 2, указывают на одновременное присутствие мутаций в генах cro и cI, 10 а также на различную степень супрес— сии в зависимости от типа присутствующего в штамме супрессора. По данным этой таблицы можно заключить, что гибридная плазмида содержит фрагмент 15

ДНК фага A с генами cI 857, cro 6.

Доказательство наличия термоиндуцированной транскрипции с левого фа— гового промотора в плазмиде, содержащей регуляторную область фага. При от-20 боре клонов, содержащих гибридные плазмиды, наряду с плазмидами типа

202, 203, 237, отбирают плазмиды с мол. массой 7,3 мегадальтон, описанные в данном примере 301 и 252 25 (фиг. 5) . Рестрикционным анализом установлено, что эти гибридные плазмиды содержат Eco RI — фрагмент фага с регуляторными генами. Кроме описанных генов этой области плазмиды содержат гены cIII, kit, j, p,и Еа10.

Обнаружено, что клоны, содержащие эти плазмицы, очень плохо растут при о

37 С. Изучают эффективность титрования этих клонов при различных температурах. Титр клеток при выращива— о нии этих культур при 43 С понижается приблизительно на четыре порядка (фиг. 6В) . При сравнении кривых роста штаммов (фиг. 6), содержащих раз- 4а личные гибридные плазмиды, показано, что эффект понижения титра клеток за—

Висит от наличия дополнительных генов и присутствия термочувствительной мутации в гене cI, которая позволяет дерепрессировать транскрипцию с ле— вого фагового промотора (P ). ПодобL ный эффект описан для лизогенных культур с 600 (А cI 875 amP), и картиро— вано местоположение гена, отвечающе- о

ro за убийство клеток. Этот ген рас— положен в N — опероне между cIII и назван kiI. Присутствие этого гена в плазмидах оказывает аналогичное дей— ствие. При непермиссивной температу- 55 ре наблюдается накопление сильно удлиненных клеток и отсутствие прямого лизиса. Отмечено сохранение характе—

43 8 ра кривой роста для клонов, переживших повьппенную температуру в течение

6 ч. Полученные данные указывают на наличие в Есо RI — фрагменте функцио— нирующего гена kil., подчеркивают его негативное влияние на рост клеток при 37-42 С, содержащих соответствующие плазмиды, и доказывают зависимость интенсивности транскрипции с фагового промотора P от температу—

L ры для генов, расположенных слева от этого промотора.

Таким образом, предлагаемый способ конструирования плазмиды позво— ляет получить мультикопийную плазми— ду, содержащую сильные промоторы с регулируемой транскрипцией.

Небольшую молекулярную массу, наличие четырех уникальных сайтов (Bam

HI, Sat. I, Есо RI, Нра I) рестрикции и их малая удаленность от соответствующих фаговых промоторов позволяет широко использовать эту плазмиду для клонирования чужеродных генов. Необ— ходимо отметить присутствие близкорасположенных сайтов эндонуклеаз рестрикции Bam HI u Sat I, которые позволяют клонировать фрагменты ДНК, пропродуцируемые такими эндонуклеазами, как Ваш HI, Bpf II, Bcf I, МЬо I, Sat (Xho) за счет идентичности "лип— ких" концов при различной специфичности узнавания, а также фрагменты, получаемые при совместном гидролизе соответствующей парой эндонуклеаз . При использовании пары Xho I

Bgt. II или Xho I — Bcf I наблюдается исчезновение сайтов рестрикции, что позволяет проводить соединение фрагментов в присутствии эндонуклеаз, не удаляя мелкий фрагмент (фиг.l).

Полученные синтетические "линкеры" обеспечивают возможность клонирования также с помощью других эндонуклеаз рестрикции.

Использование репликона мультикопийной плазмиды значительно уве— личивает дозу клонируемых генов, в присутствии мутаций в гене cI u cro обеспечивает возможность регуляции транскрипции в широких пределах. В присутствии хлорамфеникола количест— во копий плазмиды в клетке может увеличиваться на два порядка и теоретически достигать 45Х тотальной клеточной ДНК.

Присутствие в плазмице гена N, продукт которого является антитер9 12 минатором, обеспечивает в ряде случаев интенсивную транскрипцию на значительном протяжении, даже когда кло— нируемый фрагмент ДНК содержит определенные терминирующие кодоны. По приблизительной оценке подобные векторы позволяют увеличить синтез белкового продукта в сотни раз.

Наличие регулируемой транскрипции позволяет при необходимости клонировать гены, вызывающие гибель бак— териальных клеток, и получать значительные количества продуктов этих ге— нов при повышении температуры.

Известны примеры, когда введение эукариотных генов в векторную ДНК

Таблиц а 1

Фаги

/1 434 h 434Й З.i21 Avir Т4r II Т4 Ар Те

Рекомбинатные плазмиды

+ + +

Таблица 2

Показ ат ели при температуре, С

Хар акт еристики

30/38 43/38

1 1

Штаммы Е.cori

И 3350 С 600 QD 5003 N 3350 С 600 QD 5003 (сТ 857 1,0 (cI 857 cro 6 0,05

1,О 1,0

1,0

1,0

1,0

0,47

0,О3 0,15

П. 203 х 3 0,052

i 434

0,01

0,08 0,05 0,1

0,4

0,01

0,03 0,1

0,07

hcI 857 cro 6 0,04

0,3

I1 р и м е ч а н и е. В нижней части табл. 2 предс.. авлены известные данные.

201 cI

202 cI

203 cI

252 cI

301 cI

301 cI

304 c I

75043 10 фага в отличие от тех же генов в составе плазмиды дает транскрипцию этих генов под контролем левого про— мотора фага . Это позволяет пред— положить, что описанная в примере плазмида должна обеспечить эффективную транскрипцию, по крайней мере, некоторых генов эукариотного проис— хождения.

Предлагаемая плазмида является специализированным вектором, с помощью которого возможно создание штаммовсуперпродуцентов различных белков, а также некоторых других веществ био— логическоro происхождения.

1275043

Величина области гемолоПлазмида

Клон гии, мегадальтон

6,6 10

507, 504, 537

QD 5003 rec А

Cot EI.

ЛВ

4,7

3,1

pBR 322- В 6,6 10

301, 252, НВ 101 rec Л

4,7

3,1

2,4.10

202, 203, 237

HB 101 rec А

2,9

1,2 га/ гаг

Ь ь

EcoRf Нра1 8am 81 SatI Bql II

8am Hl 3, дК

pBR 322- 1

Bam HI—

Есо RI

Частоты рекомбинации, 7.

Таблиц а 3

Размер введенного фрагмента, мега— дальтон

6 3

Ж

+ о Ь ) 1275043

Юу tа

coif/

%и г.2

22 бО

20

dna Ce МХ т zoo

Вреа<е, мин РигЗ

f0 15 20

1275043

1003

605,ц оГ

Z0%

Уиг. 4

Вал I

Фиг. 5

zoz(cI

203

22и l7о 52 î 57о 42 (cz )

7(СХФ) (С1 ) (res) (Cits) 1275043

ЮЙ7

2- 2

zo/

202

201

0 1 Я Я Ф 5 б 7 Ю Я,юля,у

А 80/

-а 202

- 2Д 252

b 7 Р Гремя ч

0 / 2 У 5

80о +yO

Составитель Т. Полянская

Редактор Н. Гунько Техред М.Ходанич Корректор В. БУтЯга

Заказ 6535/21 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно †полиграфическ прецприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4