Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах
Патент 1282003
Авторы
Классы МПК
Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах
Иллюстрации
Реферат
Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - повьшение точности и чувствительности способа. К венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА), осандают эритроциты. Промывают осадок. К эритроцитарной массе добавляют раствор сапонина и затем фосфатный буфер. В раствор с ЭДТА, фосфатным буфером и глутатионом добавляют разведенный гемолизат. Через 3-5 мин добавляют еще гидроперекись трет-бутила. После инкубации осаждают белок на ледяной бане. Пробу центрифугируют. Супернатант переносят в насыщенный раствор хлористого натрия и добавляют нитропруссид натрия и двууглекислый натрий. После этого измеряют оптическую плотность при 540 им и рассчитывают активность глутатионпероксидазы. (Л
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
А1 (19) (11) Ш4С01N 33 48
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРетений и ОткРытий (21) 3779924/28-14 (22) 14.08.84 (46) 07.01.87. Бюл. ¹ 1 (7 1) Белорусский научно-исследовательский институт неврологии, нейрохирургии и физиотерапии (72) А.P.Ãàâðèëoâà и Н.Ф.Хмара(53) 612. 015 (088. 8) (56) Journal of biol chem., 1975, ч. 250,№ 13, р. 5144-5149. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа.
К венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА), осащцают эритроциты. Промывают осадок. К эритроцитарной массе добавляют раствор сапонина и затем фосфатный буфер. В раствор с ЭДТА, фосфатным буфером и глутатионом добавляют разведенный гемолизат.. Через 3-5 мин добавляют еще гидроперекись трет-бутила. После инкубации осаждают белок на ледяной бане, Пробу центрифугируют. Супернатант переносят в насыщенный раствор хлористого натрия и добавля" ют нитропруссид натрия и двууглекислый натрий. После этого измеряют оптическую плотность при 540 нм и рассчитывают активность глутатионпероксидазы.
3 2
Š— оптическая плотность станст дартной пробы (не содержащей гемолизата и гидроперекиси трет-бутила);
Š— оптическая плотность нит Р ропруссида в пробе, не содержащей супернатанта.
Пример 1. Определение активности ГП проводят в пробе с конечным объемом 0,5 мл, содержащей 50 мМ фосфатный буфер с рН 7,4, 21 мМ GSH, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в l00 раз (по отношению к эритроцитарной массе) ° о
Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакцию добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации в пробе 8 мМ. Окисление GSH останавливают через 10 мин при встряхивании в ледяной бане, осаждая белок 1мл
ЗЖ-ной НРО, приготовленной на насыщенном NaC1.
К серии опытных проб ставят контрольную и стандартную пробы. Гидроперекись трет †бути в стандартной пробе, а гемолизат в стандартной и контрольной пробах замещают соответствующим объемом дистиллированной воды.
Пробы центрифугируют при 1
2 тыс.об./мин, после чего О, 1 мл супернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного NaC1, добавляют 0,5 мя 80 мМ нитропруссида Na и 0,05 мл 1,8 М
Na СО . Экстинкцию измеряют спектрофото- или фотоколориметрически через
15 с после добавления Na CO> при .
540 нм. Фоновое поглощение нитропруссида Na определяют в пробе, не содержащей надосадка. Активность рассчитывают по формуле (1). Средняя активность ГП у 14 здоровых доноров 144,6
А22,4 ммоль/мин/л эритромассы.
1 128200
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в аналитической и клинической биохимии для определения активности глутатионпе— роксидазы (ГП) .
Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа за счет использования оптимальных концентраций субстратов и остановки реакции осаждением белка при О + 1 С. 10
Способ осуществляется следующим образом.
К 0 5-5 мл венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА, 1 мг/мл), осаждают эритроциты, про- 15 мывают осадок О, 15 М хлористым натрием, приготовленным на 0,005 М фосфатном буфере, рН 7,4, к эритроцитарной массе добавляют раствор сапонина О, 1 мг/мл в соотношении 1:2, а 20, через 30 мин — 0,05 M фосфатный бу— фер, рН 7,4, в соотношении к гемоли— зату 1:14, 1:4.
К О, 15 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,4 содержащего 0,002-0,03 М
ЭДТА и 0,025-0,035 М восстановленный глутатион (GSH), добавляют 0,05 мл разведенного гемолизата, выдерживают
3-5 мин при 37 С и начинают реакцию добавлением 0 05 мл 0,02-0,04 М гид- 3Р роперекиси трет-бутила. После инкубао дии при 37 С в течение 4-10 мин осаждают белок на ледяной бане добавлением 0,5 мл 37.-ной НРО» приготовленной на насьщенном растворе NaC1. Про-35 бу центрифугируют, 0,05-0,1 мл супернатанта переносят в 3, 9-3, 95 мл насыщенного NaC1, через 3-60 мин добавляют 0,5 мл 0,08 М нитропруссида натрия и 0,5 мл 1,8 М Na и через 15 с 4р измеряют оптическую плотность при
540 нм.
Активность ГП в 1 л эритроцитарной массы рассчитывают по формуле (С8Н1 Е„- Е.„
А = — ---, х — — — Х N
Ест Eq (GSH) — исходная концентрация
0 глутатиона;
t — время от начала до остановки реакции;
N — фактор разведения эритромассы;
Е„ — оптическая плотность контрольной пробы (не содержащей гемолизат);
Š— оптическая плотность an опытной пробы;
Пример 2. Определение актив. ности ГП проводят по примеру 1, однако среда инкубации содержит 14 мМ
GSH и гемолизат с конечным разведением в 150 раз. Реакцию начинают до-. бавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации 4 мМ, а останавливают через 5 мин. Осаждение и определение уровня остаточного глутатиона проводят по примеру 1. Активность рассчитывают по формуле (1). Активность ГП составляет
144,6 + 4 ммоль/мин/л.
Пример 3. Определение активности ГП проводят в пробе с ко нечным объемом 0,5 мл, содержащей
1282003 4 ность рассчитывают по формуле (1). Активность ГП составляет
144,6 + 4 ммоль/мин/л.
Формула изобретения
Составитель Н.Гуляева
Редактор И.Николайчук Техред Л.Сердюкова Корректор А.Ильин
Заказ 7258/41 Тираж 776 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое. предприятие, r.Ужгород, ул.Проектная, 4
50 мМ фосфатный буфер с РН 7,4, 18 мМ GSH, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в 120 раз. Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакцию о добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации 6 мМ в начальный момент реакции. Окисление GSH останавливают через 6 мин при встряхивании в ледяной бане, осаждая белок
1 мл 37.-ной НРО> приготовленной на насыщенном NaC1. Контрольную и стандартную пробы ставят по примеру 1.
Пробы центрифугируют при 1
2 тыс.об./мин, после чего О, 1 мл супернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного NaC1 добавляют О ° 5 мл 80 мМ нитропруссида Na, а затем 0,5 мл
1,8 N Na СОз. Экстинкцию измеряют через 15 с спектрофото- или фотокалориметрически. Фоновое поглощение нитропруссида Na определяют в пробе,,не содержащей надосадка. АктивСпособ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах
10 путем их гемолиза, инкубации гемолизата в присутствии восстановленного глутатиона и гидроперекиси трет-бутила с последующим спектрофотометрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, используют глутатион в концентрации 1421мМ, гидроперекись трет-бутила в концентрации 4 - 8 мМ, реак20 цию останавливают осаждением белка при температуре 0 < 1 С, а к суперо натанту добавляют нитропруссид натрия в щелочной среде.