Способ определения активности амилазы

Способ определения активности амилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к физикохимической биологии и медицине и может быть использовано для получения хромогенных субстратов при определении активности амилазы. Целью изоб- .ретения является увеличение чувствительности и сокращение времени анализа . Картофельный крахмал подвергают , набуханию в воде при 65-70°С с последующей обработкой красителем при концентрации щелочи 0,01-0,05 моль/л (рН 12) при температуре 45 - 50°С в течение 1 ч. Окрашенные гранулы крахмгша удаляют из реакционной смеси центрифугированием, промывают водой и еще раз центрифугируют. Полученную густую массу пропитывают раствором , содержащим хлористый натрий и компоненты фосфатного буфера (рН 7,2) и высушивают лио(|ильно. В качестве красителя используют дихлортриазимовый активный ярко-голубой КХ. Предварительное набухание крахмала в узком интервале температур и проведение обработки набухшего крахмала при ннзком содержании электролитов позволяет при помощи отечественного ярко-голубого красителя КХ получить высокоактивный субстрат для определения активности амилазы. 3 табл. с (Л С ю 00 ел со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU,„, 1285373 А1 ц 4 G 01 N 33/548// С 12 N 9/32

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3738256/28-13 (22) 07.05.84 (46) 23.01 87.Бюл. и 3 (71) Институт химической и биологической физики АН ЭССР и Опытный saвод органического синтеза и биопре.паратов Института химии АН ЭССР (72) P. К.Синиярв, М.Э.Хага, Х.Э.Арукаеву и Л.А.Талкоп (53) 633,534 (088.8) (56) Степаненко Б.И. Введение в хи-мию и технологию органических краси телей. М.: Химия, 1977, с.190-191.

Патент ФРГ Ф 1940869, кл. С 08 G 19/04, 1978. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АИИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к физикохимической биологии и медицине и может быть использовано для получения хромогенных субстратов при определении активности амилазы. Целью изоб,ретения является увеличение чувствительности и сокращение времени анализа. Картофельный крахмал подвергают набуханию в воде при 65-70 С с последующей обработкой красителем при концентрации щелочи 0,01-0,05 моль/л (рН !2) при температуре 45 — 50 С в течение I ч. Окрашенные гранулы крахмала удаляют из реакционной смеси центрифугированием, промывают водой и еще pas центрифугируют. Полученную густую массу пропитывают раствором, содержащим хлористый натрий и компоненты фосфатного буфера (рН 7,2) и высушивают лиофильно. В качестве красителя используют дихлортриазимовый активный ярко-голубой КХ.

Предварительное набухание крахмала в узком интервале температур и проведение обработки набухшего крахмала при низком содержании электролитов позволяет при помощи отечественного ярко-голубого красителя КХ получить высокоактивный субстрат для определения активности амилазы. 3 табл. 12853

И обретение относится к способам получения хромогенных субстратов и преимущественно может быть использовано в физико-химической биологии и медицине для определения активнос- 5 ти амилазы, Цель изобретения — увеличение чувствительности и сокращение времени анализа, Способ осуществляют следующим образом.

Картофельный крахмал подвергают набуханию в воде при 65-70 С, а обработку набухшего крахмала красителем проводят при концентрации щелочи

0,01 — 0,05 моль/л (рН 12) при 45

50 С в течение 1 ч. Окрашенные гранулы крахмала удаляют из реакционной смеси центрифугированием, промывают водой и еще раз центрифугируют.

Полученную густую массу пропитывают раствором, содержащим хлористый нат- .. рий и компоненты фосфатнoro буфера (pH 7,2), и высушивают лиофильно.

В качестве красителя используют дихлортриазимовый активный ярко-голубой КХ. Предварительное набухание крахмала в узком интервале температур и проведение обработки набухшего крахмала при низком содержании .электролитов позволяет при помощи отечественного ярко-голубого красителя KX получить высокоактивный субстрат для определения активности

35 амил азы.

Пример 1. 20 г картофельного крахмала суспендируют при комна-.ной температуре в 1 л дистиллированной воды. Набухание суспендированного 4р крахмала проводят при постоянном перемешивании при 67 С в течение 20 мин. о

Суспензию охлаждают до 48 С и прибавляют 5 r активного ярко-голубого красителя КХ, растворенного в 200 мл 45

0,02 M фосфатного буфера (рН 9). Через 15 мин к реакционной смеси прибавляют 5 мл 2 н. раствора NaOH.pH суспензии повьппается при этом до 12 (концентрация NaOH составляет при этом 0,01 M). Продолжительность реакции прн постоянном перемешивании о и при 48 составляет 1 ч. Гранулы крахмала выделяют из реакционной среды 15-минутным центрифугированием при 3000 об/мин, промывают водой и снова центрифугируют, Полученную густую массу гранул крахмала суспендируют в 200 мл раствора, .содержаще73 2 го 5,32 г ля НРО 12H,О и 6,57 г

NaCl. Полученную суспензию высушивают лиофильно н получают 25 г синего порошка. Полученный окрашенный субстрат используют для определения активности амилаэы. В пробирках взвешивают по 40 мг окрашенного крахмала н прибавляют 2,3 мл дистиллированной воды. Суспензию термостатируют

5 мин при 37 С и прибавляют в каждую пробирку 0,2 мл раствора х -амилазы, содержащего 0 — 3,75 мг/л ферментного препарата фирмы Merck с активностью 277 международных единиц на

1 мг ° Продолжительность реакции о

15 мин при 37 С. Реакцию останавливают прибавлением 0,5 мл 1,0 М раствора соляной кислоты. Реакционную смесь центрифугируют в течение,3 мин ! при 1600 об/мин и определяют оптическую плотность центрифугата на одЪ нолучевом спектрофотометре Specol

21 при 620 нм. Оптическая плотность по отношению к пробе С нулевым содержанием -амилазы прямо пропорционально зависит от количества ферментного препарата в растворе, в котором проводится его определение (см.табл.1) .

В скобках при количестве прибавляемого фермента также приведена активность в международных единицах, которая получается в результате умножения количества прибавляемого ферментного препарата в 1 л раствора на его первоначальную активность (см.табл.1).

Для определения активности а6 -амилазы определенное количество окрашенного крахмального порошка суспендируют в воде, термостатируют и прибавляют пробу., содержащую оС -амилазу,инкубируют при постоянной температуре, отделяют непрореагировавший крахмал и фотометрически определяют оптическую плотность при 620 нм. По калибровочной кривой или по формуле,А

= hD K, где А — активность с6 -амилазы в исследуемой жидкости, Е/л;

Юа — оптическая плотность пробы при 620 нм по отношению к пробе с нулевым содержанием Ы, -амилаэы; К переходный коэффициент, который характеризует реакционную способность хромогенного субстрата и определяется при помощи стандарта с известной активностью, рассчитывают активность

Ж-амилазы в исследуемом растворе.

12853

Проводят сравнение реакционной способности субстрата, полученного по предлагаемому способу, с общеизвестными таблетками "Phadebas" фирмы

Pharmacia для определения активности о -амилазы в сыворотке крови человека.

Определение активности N -амилазы в сыворотке при помощи таблеток "РЬаdebas" проводят по методике фирмы.

В пробирки помещают 4 мл дистиллированной воды и прибайляют одну таблетку, которая набухает в воде. Полученную суспензию термостатируют в течение 5 мин при 37оС, прибавляют

0,2 мл сыворотки крови человека, встряхивают и термостатируют 15 мин о при 37 С. Реакцию останавливали прибавлением 1,0 мп 0,5 M раствора гидроокиси натрия. Реакционную смесь центрифугируют 5 мин при 1600 об/мин и определяют оптическую плотность при 620 нм. Активность ot. -амилазы в сыворотке в.международных единицах на 1 л сыворотки (Е/л) находят по калибровочной кривой.

Определения с окрашенным крахмалом,полученным по предлагаемому способу, проводят по указанной методике.

Вместо раствора сь -амилазы прибавля30 ют 0,2 мл сыворотки. Активность, амилазы (А) в международных единицах на 1 л сыворотки рассчитывают по формУле:.А = АЭь „. К, где АПб о — оп-. тическая плотность пробы по отношению к пробе с нулевым содержанием о -амилазы при 620 нм;

К вЂ” константа, характеризующая реакционную способность хромогенного субстрата с о -амилазой, которая

40 определяется по методике примера 2 при помощи стандарта оь-амилазы с известной активностью. В данном случае

К =* 954. Полученные результаты приведены в табл.2.

Пример 2. Приводятся экспериментальные данные, показывающие влияние солей и условий набухания крахмала на реакционную способность полученного хромогенного субстрата.

20 r картофельного крахмала суспендируют при комнатной температуре в 1 л дистиллированной воды. Набухание суспендированного крахмала проводят при постоянном перемешивании . при 67 С. Температурный промежуток, в котором возможно проводить набуо хание, 65-70 С. Так как промежуток

73 Д маленький, опыты праводяч ся при средо нем значении 67 . При температуре о выше 70 крахмал становится слишком набухшим, сниженным, что 3 ат руди яе т дальнейшую обработку крахмала красителем, а при температуре ниже 65 и полного набухания не происходит и получают малоактивный препарат. После набухания суспензию охлаждают до

50 С и разделяют на четыре порции о по 250 мп, Первую порцию окрашивают по примеру 1, прибавляя 1,25 r активного ярко-голубого красителя КХ, растворенного в 50 мл 0,02.М фосфатного буфера. рН доводят до 12 прибавлением 1,25 мл 2 н.раствора БаОН (концентрация NaOH составляет при этом

0,05 М).

Вторую порцию окрашивают прибавлением 1,25 r этого же красителя, растворенного в 50 мл дистиллированной воды, а рН доводят до 12 прибавлением 2 н.NaOH, постоянно проверяя рН смеси рН-метром.

Третью порцию окрашивают прибавлением 1,25 r этого же красителя, растворенного в 40 мл дистиллированной воды; рН суспензии переводят в щелочную область прибавлением 10 мл

1,5 M раствора На РО4 .

В четвертую порцию прибавляют

1,25 r этого же красителя, растворенного в 40 мл дистиллированной во- . ды, и 28 г безводного Na $0 . рН суспензии переводят в щелочную область прибавлением 10 мл 1,5 М раствора Na>PO .

Пятый и шестой образцы получают набуханием 10 r картофельного крахмала в 500 мл дистиллированной воды при постоянном перемешивании при о

50 С в течение 1 ч. Суспензию разделяют на две порции по 250 мл.

Пятый образец подвергают окрашиванию по методике первой порции, а шестой — по методике четвертой порции.

Во всех случаях окрашивание, проводят при постоянном перемешивании

0. при 50 С в течение 1 ч. Гранулы крахмала выделяют иэ реакционной среды центрифугированием, проьывают водой и снова центрифугируют.Все образцы, полученные в виде густой массы, суспендируют в 50 мл раствора, содержащего 1,33 г Na, HPO х

2 х 12Н О и 1,65 г NaCl, pH суспензий

5 128537 доводят до 7,2 добавлением 2 М раствора HCI, Полученные суспензии высушивают лиофильно в лиофилизаторе.

Качество т .олученного окрашенного .крахмала как субстрата для определения ферментативной активности оС -амилазы характеризует скорость его гидролиза под действием фермента,Определение ферментативной активности проводят по примеру 1, прибавляя в Ю пробирки по 40 мкг препарата К -амилазы. Полученные результаты приведены в табл.3, где дР о прямо пропорциональна скорости ферментативного гидролиза. 15

Из приведенного примера видно,что повыпение коицентрации солей в растворе окрашивания и особенно понижение температуры набухания крахмала приводят к понижению реакционной спо-20 собности синтезированного субстрата. .Таким образом, использование красителя с двумя активными группами по сравнению. с известным спдсобом, в котором используется краситель с одной активной группой, и проведение окрашивания набухшего при 65-70 С крахмала при концентрации щелочи

0,01"0,05 моль/л при отсутствии посторонних электролитов в отличии от ЗО

3,0 3,7$ (831) (1039) Концентрация (активность) О, 75 ферментного препарата, мг :1 (Е/л) (208) 2,25

1,50 (623) (416) 0,22

0,43

0,65

0,89 1,08

Таблица 2 .

0,205 .196

О, 310

213

2 0,495

3I4

0,342 326

3 0,926

4 0,996

529

562

0,555, 530

0,582 555

1,027 980

5 1,974

6 2,957

7 0,297

1391 1,480 1412

205 0,226 216

Оптическая плотность при

620 нм

3 б известного способа, в котором процесс проводят без предварительного набухания и в присутствии сульфата натрия (до 107-й концентрации) позволяет сделать вывод, что при использовании предлагаемого способа увеличивается чувствительность и сокращается время анализа при определении активности амилазы.

Формула изобретения

- Способ определения активности амилазы, предусматривающий получение хромогенного субстрата путем обработки крахмала активным красителем в щелочной среде, промывание и высушивание окрашенного крахмапа, смешивание его с раствором амилазы и анализ полученного раствора, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения чувствительности и сокращения времени анализа, крахмал перед обработкой активным красителем подвергают набуханию в воде при 65-70 С, при" чем в качестве красителя используют ярко-голубой КХ, а обработку крахмала красителем ведут при температуре от 45 до 50 С и концентрации ще.о лочи от 0,01 до 0,05 моль/л.

Т аблиц а 1

1285373

Та блица3

Концентрация, г/л, фосфата в виде

ТемпеОбразец ратура набухания, С

Na РО Ма,S04 Ь D6ãî

0,75

0,55 О

О.

0,77

0 55

8,25

0,06

93,3

8,25

0

0,55

50.

93,3

8,25

Составитель А.Синицын

Техред H.Ïîïîâè÷ Корректор М.Демчик

Редактор А.Сабо

Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5

Заказ 7638/46.Производственно-полиграфическое предприятие, r.Ужгород, ул.Проектная, 4