Способ получения щелочной фосфатазы

Способ получения щелочной фосфатазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

OOI03 СОВЕ ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧ Г СКИУ

РЕСПУБЛИК (я>» С 12 N 9/16

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3891419/13 (22) 29,04.85 (46) 07,11,92. Бюл, ¹ 41 (71) Научно-производственное объединение

"Биолар", Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР и Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов (72) Э.А.Аренс, В.Х,Кирсис, Р.Я.Бейнаровича, И.З.Киршбаумс, M.À.Ðóòêèñ, P.Э.Салмане, Г.Л,Ермолин, О.Г.Саканделидзе, И. lCI. Сахаров, Е,Е. Ефремов, Е,С.Гиршович и И.Е.Макарова (56) Cathala G., Brunel С., Chappelet-Tordo О., Laxdunskl M.G. Biol. Chem, 1975, vol.250,15, р р. 6040-6045, Davies M,Y. Motzok Y, Comp. Biochem

Physiol., 1972, vol.42В, рр.345 — 346.

Изобретение относится к области получения очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе и в производстве нуклеозидов из нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является повышение активности фермента. упрощение технологического процесса и расширение сырьевой базы.

Получение щелочной фосфатазы активностью 125-130 ед/мг белка достигается суммарным действием ряда факторов; использование в качестве сырья отходов промысла морского зверя -- тонкий кишечник тюленя позволяет расширить сырьевую базу получения щелочных фосфатаз животного происхождения и за счет высокого содержания фермента и в ткани получить гомогенизат со сравнительно вы5Ц 1287593 А1 (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ

ФОСФАТАЗЫ, включающий гомогенизацию исходного сырья животного происхождения, экстракцию II áóòàíîëîì, разделение фаэ и хроматографическое разделение, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения активности фермента, упрощения технологического процесса и расширения сырьевой базы, в качестве исходно о сырья используют отходы промысла морского зверя — тонкий кишечник тюленя. экстракцию ведут при 35 — 40 С, водную фазу диализируют с последующим осаждением этанолом из диализата ферментного препарата при конечной концентрации 55 — 55 об.%, причем хроматографическое разделение осуществляют на ДЭАЭ-сфероне. сокой исходной активностью без предварительной стадии отделения слизистой, что существенно упрощает этап первичной обработки сырья; возможность из первичнои обработки сырья исключить трудоемкий процесс отделения слизистой обусловлена также более эффективной очисткой фермента на последующих стадиях, повышение температуры до 35-40"С способствует более эффективному проведению зкстракции липидных примесей н-бутанолом с одновременной очисткой от термолабильных белков, которые денатурируются и выпадают в осадок, осаждение этанолом проводится при оптимальной для осаждеHèÿ щелоч, lой фосфатазы тюленя конечной концентрации этанола 55-65%, что способствует Увеличению выхода по активности. Крол1е того, на данной стадии происходит конц .Нтрирование

1287593

Составитель

Техред M,Mîðãåíòàë

КоРРектоР Е.Г1апп

Редактор Л.Письман

Заказ 544 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 предварительно уравновешенную буфером

А, Нанесение раствора щелочной фосфата-, зы и элюирование осуществляют градиентным программируемым микронасосом PPM (ЧССР) со скоростью протока 1,2 л/ч. Элюи- 5 рование проводят в градиентном режиме с увеличивающейся в элюирующем буфере А концентрацией NaCI от 9 до 1 М, В процессе хроматографирования отбирают фракции по 20 мл, В полученных фракциях определя- 10 ют активность щелочной фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельную активность фермента и выход по активности.

После хроматографической очистки на 15

ДЭАЭ-сФеооне активности щелочной фосфатазы составляет 125 ед/мг белка, выход по активности 80,57.

Пример 2, 0,5 кг свежезамороженного 20 тонкого кишечника тюленя размельчэют, загружают в гомогенизатор, добавляют

0,5 л TM буфера и проводят гомогенизацию до получения гомогенной массы. Получают

2 л гомогенизата. 25

К гомогенизату добавляют 2 л н-бутанолэ и проводят экстракцию при 37 С в течение 1,5 ч, После экстракции и разделения фаз бутанольную фазу отбрасывают, а водную фазу(1,2л) диализируют против 10-л TM 30 буфера в течение 24 ч при 4"С. Буферный раствор заменяют свежим чере-:, 12 ч, I,ñ лучают 1,6 л диализата.

К полученному диэлизату при медленНоМ перемешивании добэвля;от предварительно охлажденного до 4 C этанолз до конечной его концентрации 60 об.;/,,, выдерживают в течение 30 мин при 4 С и осадок отделяют центрифугированием. ПолученHblA осадок растворяют в 250 мл буфера А и фильтруют для удаления нерастворившихся частиц.

Фильтрат наносят на колонку размером

5 х 30 см, наполненную ДЭАЭ-сфероном и предварительно уравновеше ную буфером

А, Нанесение раствора щелочной фосфатэзы и элюирование осуществляют градиентным программируемым микронасосом РРМ (ЧССР) со скоростью протока 1,2 л/ч. Элюирование проводят в градиентном режиме с увеличивающейся в элюирующем буфере А концентрацией NaCI от 0 до 1 M. В процессе хроматографирования отбирают фракции по 20 мл, В полученных фракциях определяют активность щелочной фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельную

BKTwBHocTb фермента и выход по активности.

После хроматогрэфической очистки на

ДЭАЭ-сфероне активность щелочной фосфэтазы составляет 130 ед/мг белка выход по активности 84%.