Способ определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале

Способ определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для определения лейцинаминопептидазы (ЛАП) в биологическом материале. Цель - ускорение и повышение чувствительности способа. Образец (ликвор, фракции ткани мозга) наносят на хроматографическую колонку с приспособлением для центрифугирования, заполненную сефадексом G-75, центрифугируют 2 мин при 3000 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором , затем 1-4%-ньам раствором формальдегида для удаления балластных белков и центрифугируют 2 мин при 3000 об/мин. Далее на колонку наносят 6-9%-ный раствор формальдегида, который избирательно элюирует фер-. мент и одновременно активизирует его, оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре, центрифугируют 2 мин при 3000.об/мин. Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности с помощью ЛАП-теста фирмы Fermognost, Удельная активность ЛАП, выделенной из биологических жидкостей и ткани мозга, равна 15-30 ед/мг белка. с и taoA, ю со со Од О 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИ ( (19) (11) (51) 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ

Н A BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3964831/28-14 (22) 30.09.85 (46) 28.02.87. Бюл. Р 8 (71) Первый Московский медицинский институт им.И.N.Сеченова (72) А.П.Хохлов и Т.С,Баскаева (53) 616.07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1114699, кл. С 12 N 9/48, 1984. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕИЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКО11 МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для определения лейцинаминопептидазы (ЛАП) в биологическом материале °

Цель — ускорение и повышение чувствительности способа. Образец (ликвор, фракции ткани мозга) наносят на хроматографическую колонку с приспособлением для центрифугирования, заполненную сефадексом G-75, центрифугируют 2 мин при 3000 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, затем 1-4Х-ным раствором формальдегида для удаления балластных белков и центрифугируют 2 мин при

3000 об/мин. Далее на колонку наносят 6-9Х-ный раствор формальдегида, который избирательно элюирует фер-. мент и одновременно активизирует его, оставляют на 30-40 мин при комнат- ной температуре, центрифугируют 2 мин при 3000 об/мин. Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности с помощью ЛАП-теста фирмы "Регшодпоз1".

Удельная активность ЛАП, выделенной из биологических жидкостей и ткани мозга, равна 15-30 ед/мг белка.!

2936

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале.

Цель изобретения — ускорение и по- 5 вышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Ликвор (фракции ткани мозга) наносят на хроматографическую колонку с приспособлением для центрифугирования, заполненную сефадексом G-75, центрифугируют в течение 2 мин со скоростью 3600 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, за15 тем 1-4Х-ным раствором формальдегида для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин.

Далее на колонку наносят 6-9 -ный раствор формальдегида, оставляют на

30-40 мин при комнатной температуре и вновь центрифугируют ее в течение

2 мин со скоростью 3000 об/мин.

Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию

его активности с помощью ЛАП-теста фирмы "Fermognost".

Одновременно в исследуемых образцах проводят количественное определение белка методом Лоури и удельную активность фермента выражают на 1 мг белка.

При этом удельная активность лейцинаминопептидаза (ЛАП),выделенного из биологических жидкостей и ткани мозга, колебалась в пределах от !5 до

30 ед/мг белка.

Полученный положительный эффект 40 обусловлен выявленным свойством формальдегида в концентрации от 6 до 9 избирательно элюировать фермент с хроматографической колонки и одновременно активировать его. 45

Опытным путем установлена оптимальная концентрация формальцегида— в пределах от. 6 до 9 .

1"4Х-ный раствор формальдегида смывает лишь балластные белки, 4—

5 -ный раствор частично элюирует фермент (не более 60 ).При концентрации выше 9Х фермент инактивируется.

Время контакта оптимальной концентрации формальдегида (6-9 ) с сорбированным на колонке ферментом колеблется в пределах 30 — 46 мин. При инкубации в течении 10 — 25 мин (за счет недостаточной десорбции фермен58 г та) и при инкубации более 45 мин (за счет инактивации) активность фермента снижалась.

Пример 1. Ликвор больного с рассеянным склерозом наслаивают на хроматографическую колонку (с приспособлением для центрифугирования), заполненную сефадексом G-75, центрифугируют в течение 2 мин со скоростью

3000 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, а затем 1.—

4Х-ным раствором формальдегида для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью

3000 об/мин. Далее сорбированный на колонке фермент инкубируют 30 мин при комнатной температуре в присутствии

9Х-ного раствора формальдегида с последующим центрифугированием при

3000 o6/мин.

Удельная активность ЛАП в исходном ликворе О, после инкубации сорбированного на колонке фермента в присутствии 9Х-ного раствора формальдегида 30 ед/мг белка.

Таким образом, время выделения фермента сокращается до часа по сравнению с 72-96 ч, в известном способе.

Одновременно чувствительность способа повышается в 4 раза.

lT р и м е р 2. B ткани мозга выделение фермента проводят из грубоочищенных препаратов миелина. Для этого

3,0 r ткани мозга кролика гомогенизируют в присутствии 20 мл 0,32 М сахарозы, наслаивают гомогенат на 0,85М раствора сахарозы, центрифугируютпри

26000 об/мин в течение 60 мин.

Фракцию миелина суспензируют дву-, мя объемами дистиллированной Н О, центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин, Осадок обрабатывают 14 мл физиологического раствора (500-600 белка/мл) и полученную суспензию наносят на две хроматографические колонки.

В одном случае процедуру выделения проводят аналогично примеру 1.

Вторую колонку оставили в холодильнике на 4 дня. Фермент элюировали физиологическим раствором.

Удельная активность ЛАП в исходной суспензии миелина 0,03 ед/мг белка. После инкубации сорбированного на колонке фермента в присутствии

3 1293658

6Х-ного формальдегида удельная актив- т ность 21 ед/мг белка. о

Составитель Н,Валеева

Редактор В.Ковтун Техред А.Кравчук Корректор Г.Решетник

Заказ 381/50 Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород,ул.Проектная,4 формул а изобретения

Способ определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале путем нанесения пробы на колонку, заполненную сефадексом G-75 с последующим вымыванием балластных белков физиологическим раствором, инкубацией сорбированного на колонке фермена, элюцией фермента с последующим пределением его сгектрофотометрически с помощью субстрата лейцингидразида, отличающийся тем, 5 что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, балластные белки дополнительно смывают 1-4Х-ным раствором формальдегида, а инкубацию проводят в течение 30-45 мин в присутствии 6-9Х-ного раствора формальдегида.