Липосомальная везикула для направленного транспорта биологически активных веществ

Липосомальная везикула для направленного транспорта биологически активных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине , в частности.к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для транспорта лекарств .в области мишени. Целью изобретения является повьшение степени селективного поглощения везикул макрофагами. Оболочка липосомштьной везикулы 1 состоит из фосфолипидов 2 и фибронектина, модифицированного производными жирных кислот или фосфолипидов, причем поверхностный белковый слой оболочки образован белковыми частями 3 молекул модифицированного фибронектина, а гидрофобные части молекул (образованные модификатором) встроены в оболочку. 1 ил., 6 табл. р (Л с со 4 о О5

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 А 61 К 9 50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОВСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3827789/28-13 .(22) 19,12,84 (46) 07.04.87,Бюл. К 13 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр (72) С.А.Бурханов, В.П.Торчилин, Г.А.Ермолин, В.Э.Котелянский, Е.Е.Ефремов, И.Н.Трахт, А.Л,Клибанов и А.Н.Лукьянов (53) 615.7 (088.8) (56) V.P.Torchilin et.al. Coating

liposomes with protein decreases

their capture by macrophages.

F.EBS I etters, 1980, V. III, Ф 1, р.184 — 188,Л0 I 301406 А 1 (54) ЛИПОСОИАЛЬНАЯ ВЕЗИКУЛА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относит ся к медицине, в частности.к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для транспорта лекарств, в области мишени. Целью изобретения является повьппение степени селективного поглощения везикул макрофагами, Оболочка липосомальной везикулы 1 состоит из фосфолипидов 2 и фибронектина, модифицированного производными жирных кислот или фосфолипидов, причем поверхностный белковый слой оболочки образован белковыми частя- д ми 3 молекул модифицированного фибронектина, а гидрофобные части молекул (образованные модификатором) встроены в оболочку. 1 ил., 6 табл. С:;

1 13014

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для транспорта лекарств в области мишени., 5

Цель изобретения — повышение степени селективного поглощения везикул макрофагами, На чертеже изображена лино-.омальная везикула, 10

Оболочка липосомальной везикулы 1 состоит из фосфолипидов 2 и фибронектина, модифицированного дитиодипропионил-фосфатидилэтаноламином причем поверхностный белковый слой оболочки образован белковыми частями 3 молекул модифицированного фибранектина, а гидрофобные части молекул, образованные модификатором 4, встроены в оболочку. 20

Таким образом, существенными признакамц предлагаемой липосомальной везикулы являются наличие конструктивных элементов — оболочка везикулы содержит специфический внешний поверх костный слой, сформированный молекулами модифицированного фибронектина; материалы, т.е. вещества, из которых состоят элементы везикулы — фосфолиыф.д а рН35 и ®

НООС

Модисрик ото (ДТДП-ФЗ) 1 беяиабая

NH . ость мопен злы — Рго е n — 1 Н вЂ” С

+ Pr0hei, РН 85 (И

О " 0О" " "" Моди(риццробонный фи д/юне тин

Гифорайная

ЧОCrnb МаЛакыры

Модификация фибронектина, Для связывания фибронектйна с липосомами использована предварительная гидрофобная модификация молекул белка дитиодипропионил-фосфатидилэтаноламином. Для этого 1 мг последнего растворяют в 100 мл -диметилсульфоксида и добавляют 1 мл 0,15 М МаС2. После

55 энергичного встряхивания к полученному раствору добавляют 2 мг 1-этил3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (рН 3,5), Через 10 мин добавляют

2 мг фибронектина, растворенного в

Цель изобретения достигается совокупностью указанных выше признаков, относящихся как к составу, так и строению объекта. При этом структура и строение липосомальной оболочки являются не менее существенным признаком, чем состав исходных компонентов, поскольку именно наличие поверхностного белкового слоя обуславливает эффективность поглощения веэикул макрофагами.

Липосомальные везикулы получают следующим образом.

06 2 пидный состав оболочки, фибронектин, модифицированный производными фосфолипидов (каждую из молекул которого можно условно разделить на белковую часть, образуемую остатком собственно фибронектина, и гидрофобную часть, образуемую модификатором) связь между элементами объекта, характеризующаяся тем, Ао одной своей частью (гидрофобной) молекулы модифицированного фибронектина встроены в фасфолипидную оболочку везикулы, а другой (белковой), экспонированной на поверхности оболочки, образуют поверхностный белковый слой.

Схема модификации фибронектина может быть условно выражена следующим образом (в качестве модификатора использован дитиодипропионил-фосфатидилэтаноламии - ДТДП-ФЭ), I. ДТДП-ФЭ активируют в водной среде водорастворимым карбодиимидом (рН 3,S).

К активированному ДТДП-ФЭ добавляют фибронектин в боратном буфере (pH 8,5), В результате аминогруппы фибронектина модифицируются остатками ДТДП-ФЭ, l301406

О

НООС вЂ” (СН СΠ— NH — СН вЂ” Π— P — P

ll

0,7 мл 0,1 M боратного буфера (рН 8„5) .

Липосомы готовят из яичного лецитина, общих фосфолипидов и ганглиозидов печени и холестерина методом об5 ращенных фаз, соотношение фосфолипида и холестерина 7:3. Для регистрации захвата в липосомальную мембрану встраивают необменивающуюся метку холестерил 14-С-олеат (фирма "Amers- ц1

ham"), Количество фосфолипидов оценивают по содержанию Р„, Белок измеряют по методу Лоури, 0 п ы т 1, 5 мг лецитина и 1,44 мг холестерина растворяют в хлороформе 15 и упаривают на роторном испарителе до получения пленки, Полученную пленку растворяют в 3 мл диэтилового эфира и добавляют 1,6 мг модифицированного фибронектина в 1 мл боратного 29 буфера. Полученный раствор обрабатывают ультразвуком, После удаления из раствора на роторном испарителе эфира получают однослойные липосомы, что контролируется электронной микроскопией.

0 п ы т 2, Получают фибронектин, модифицированный ДТДП- Э, Смешивают его с равным объемом предварительно сформированных липосом (концентра-, ция липида 3 мг/мл) и инкубируют

20 ч, При этом фибронектин встраивается своими гидрофобными остатками в мембрану уже готовых липосом за счет гидрофобного взаимодействия остатков фосфолипида в молекуле белка с липидной мембраной, 0 п ы т 3 ° Проводят аналогично опыту 2, но фибронектин смешивают с раствором липида (концентрация

5 мг/мл) в детергенте (2 7. хелат, 0,15 M NaC2, 10 MM 11аН РО, рН 7,4) и диализуют 18 ч против буфера не содержащего детергента, При этом об- . разуются липосомы,содержащие молекулы фибронектина на мембране липосом, причем остаток фосфолипида белка встраивается в мембрану липосомы, 0 п ы т 4, Проводят аналогично опыту 2, но вместо ДТДП-ФЗ используют глутарил-ФЭ. в тех же концентрациях и при том же времени инкубации.

0 п ы т 5. 1 мг фибронектина в

20 мг/мл хелатном буфере (1 мл), со-. держащем 0,15 M NaC2 и 0;1 M Na HPO рН 8,0, смешивают с 10 мл IOX-ного раствора пальмитоилхлорида в ацето-, о

40 не при 4 С, Через 1 ч осадок пальмитиновой кислоты отцентрифугирывают (12000, 15 мин) и отбрасывают, добавляют равный объем раствора липидов (концентрация 10 мг/мл) в том же буфере, Инкубируют 30 мин и диализуют 18 ч против такого же буфера, не содержащего хелата.

При этом самопроизвольно из смешанных мицелл липид — детергент белок образуются липосомы,в мембрану которых встроен фибронектин, За структурой образующихся комплексов фибронектин — липосома можно следить методом электронной микроско- пии.

Несвязавшийся белок может быть легко и быстро отделен бт липосом флотацией в ступенчатом фиколла или гель-фильтрацией в центрифуге на сефарезе CL 4B.

Используют трансформированные макрофаги мьппи линии 1774. На монослой

4 клеток (7 10 ) в лунке наносят аликвоту липосом и инкубируют при 37 С

1 ч. После удаления во флаконы с сцинтилляционной жидкостью ЖС-8 подсчитывают на счетчике RACKBFÒÀ 1215 (фирма L KB), Для определения эндоцитоза липосом макрофагами клетки преинкубируют 40 мин гликолитическим ингибитором эндоцитоза — йодацетамидом (100 мкмоль).

Пример 1. Сравнивают связывание и эндоцитоз макрофагами (? . 10 " клеток) липосом из лецитина без фибронектина и покрытых фибронектином.

Содержание липида 1,5 мг/мп и фибронектина 0,7 мг/мл, Данные приведены в табл, 1 и 2.

Пример 2. Сравнивают связывание и эндоцитоз макрофагами липосом из фосфолипидов и ганглиозидов

1406 ции е

Связывание липосом в

Эндоцитоэ липосом (пшо1 липида) Состав липосо Захват липосом (nmo 1 липида) присутствии йодацетамида (nmol липида

0,74+0,18 0,43+0,02

0,31

Лецитин

Лецитин + фибронектин 1,7 + 0,3

1,04

0 43 0,07

П р и м е ч а н и е: После гомогениэации липосом ло размеру ((4 »), Таблица 2

Захват

Эндоцитоз липосом (пп»о1 липида) Со ст ав лип о сом

Захват липосом в присутствии йодацетамида (гп ol липида) липо сом (nmo1 липида) 0,29+0,03 0,08

0,37+0,02

Лецитин

Лецитин + фибронектин 2,74+0,42 0,73+0,08

2,01

5 130 печени. Содержание липида 1,5 мг/мл, ганглиозидов, фибронектина 0,7 мг/мл.

Данные приведены в табл. 3 и 4 °

Пример 3. Проверка специфического взаимодействия макрофагов с липосомами, содержащими фибронектин, по сравнению с липосомами, содержащими бычий сывороточный альбумин.

Приготовляют липосомы, содержащие лецитин:холестерин (1:1), в которые встроены через гидрофобную "ножку" фибронектин и бычий сывороточный альбумин (БСА). Весовое соотношение компонентов то же, что в примере 1, Количество альбумина эквивалентно содержанию ФН, В табл.5 дано количество липосом, связавшихся с клетками макрофагов линии 1774 (распадов/мин С-холесте» » рико-олеата, связанного с липосомами), Исследуется кинетика связывания с макрофагами липосом, полученных на основе лецитина и лецитина с фибронектином.

В табл,б приведены данные о свя-, зывании липосом из лецитина и лецитина с фибронектином с макрофагами

Х774 в зависимости от времени инкуба6

Таким образом, фибронектин повышает фагоцитоз липосом макрофагами до 20 раз.

Использование изобретения .обеспечивает высокую степень захвата липо- сом макрофагами, стимуляцию фагоцитоэа липосом макрофагами, возможность применения липосомальных веэикул для транспорта БАВ, 10

Формула изобретения

Липосомальная везикула для направленного транспорта биологически активных веществ, содержащая оболочку, состоящую из фосфолипидов и внешнего белкового слоя, о т л и ч а ю— щ а я с я тем, что, с целью повышения степени селективного поглощения

20 везикул макрофагами, оболочка дополнительно содержит фибронектин, модифицированный производными жирных кислот или фосфолипидов, а внешний белковый слой образован белковыми частями молекул модифицированного фибронектина, при этом гидрофобные части его молекул, образованные модификаторо1», встроены в фосфолипидную оболочку.

Таблица 1

1301406

Т аблица 3

Эндоцитоз липосом (пшо1 липида) Захват лиСостав липосом осом в присутствии одацет амида (nmol липида) 1,44+0,ll

2,23

Фосфолипиды + 3 э67+ 0,09 г англио зиды

Фосфолипиды + ганглиозиды + 5э77+Оэ25 фибронектин

3,07

2э70+Оэ45

П р и м е ч а н и е. После гомогенизации липосом по размеру (< 4P), Таблица 4

Захват липоСостав липосо Захват липосом (nmol липида) сом в присутствии йодацет амида (nmo 1 липида) Оэ86+Оэ11

Фосфолипиды + 1э22+Оэ08

r англио зиды

0,36

5э61+Оэ59

Зэ47+Оэ34

2,14

Т аблица 5

Распад/мин при температуре, С

Э7 (4

Состав липосом

211 +32

97 э 7

Лецитин

Лецитин + 2967 + 111 фибронектин

304 +40

Лецитин +

БСА

600 59

126 +6

Фосфолипиды + .ганглиозиды + фибронектин

Захват липо сом (nmo1 липида) Эндоцитоз липосом (пшо1 липида) 1301406

Таблица 6

Состав липосом

Распад/мин при температуре, С

Время инкубации мин

68 14

Лецитин

86 8

120

180

Лецитин + фиб- 30 ронектин

120

180

Составитель Н. Кузенкова

Техред М.Ходанич

Редактор И.Горная

Корректор С, Шекмар

Тираж 596 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д,4/5

Заказ 1172/4

Производственно-полиграфическое предприятие, r.ужгород, ул.Проектная, 4

261 + 22

247 + 19

319 + 40

349 31

1305 + 210

2718 + 260

4106 + 140

4533 + 280

98 +12

97+ 13

152 < 19

200 +14

203 +20

261 +15