Способ получения противогриппозных антител

Способ получения противогриппозных антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, предназначено для производства диагностических и лечебных сывороток. Цепь изобретения - пролонгирование повышенных титров антител. Для этого получают вирусосодержащую жидкость, используя 10- 1 -дневные куриные эмбрионы, в аллантоисную полость которых вводят аллантоисную культуру вируса гриппа А (Гонконг/1)68(Н3112). Аллантоиснук) вирусосодержап;ую жидкость центрифугируют на холоду при 5000 об/мин 20 мин для удаления механических примесей. Очистку вирусной, сусцензии ведут методом фильтрационной хроматографии на колонках с макропористым силохромом. Очищенную вирусную суспензию инактивируют ультрафиолетовым облучением. Очищенный инактивируемый вирус с титром Г: :800 ГА/0,2 мл совместно, в одном шприце с трипсином и поливиниловым спиртом (массовое соотношение трипсина и поливинилового спирта 1:2- 1:20) в объеме 0,15 М раствора хлористого натрия вводят подкожно лабораторным животным, В полученных из их крови сыворотках .определяют антигемагглютинирующую активность в реакции торможения гемагглютинации. Предлагаемьй способ позволяет повысить титры специфических антител в сыворотках крови животных-продуцентов в 2-12 раз, при этом увеличиваются сроки использования живртньгх, получают более высокотитражные сыворотки , которые используют для производства диагностических и лечебных препаратов, 1 з.п. ф-лы. Q (О (Л со о 4 О СО

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (50 4 .А б1 К 39/12 / ф;г 4 "1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3835191/28-14 (22) 02.01.85 (46) 07.04,87. Бюл. 11 - 13 (71) Физико-химический институт им, А.В.Богатского и Научно-исследовательский институт вирусологии и эпидемиологии им, И,И.Мечникова (72) Т.И.Давиденко, В,П.Лозицкий, А.В.Чуенко и Л.Е.Пузис (53) 615.373(088.8) (56) Респираторные вирусные инфекции: Труды ИЭМ им. Пастера. !973, т, XII с. 78-83. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОГРИППОЗННХ АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к медицине и ветеринарии, предназначено для производства диагностических и лечебных сывороток. Цель изобретения пролонгирование повышенных титров антител, Для этого получают вирусосодержащую жидкость, используя 1011-дневные куриные эмбрионы, в аллантоисную полость которых вводят аллантоисную культуру вируса гриппа

А (Гонконг/1)68(H3112). Аллантоисную вирусосодержащую жидкость цент„„Я0„„1301409 А1,рифугируют на холод - при 5000 об/мин

20 мин для удаления механических примесей. Очистку вирусной. суспензии ведут методом фильтрационной хроматографии на колонках с макропористым силохромом. Очищенную вирусную суспензию инактивируют ультрафиолетовым облучением ° Очищенный инактивируемый вирус с титром 1:

:800 ГА/0,2 мл совместно, в одном шприце, с трипсином и поливиниловым спиртом (массовое соотношение трипсина и поливинилового спирта 1:21:20) в объеме 0,15 М раствора хлористого натрия вводят подкожно лабораторным животным. В полученных из их крови сыворотках .определяют антигемагглютинирующую активность в реакции торможения гемагглютинации.

Предлагаемый способ позволяет повы1 сить титры специфических антител в сыворотках крови животных-продуцентов в 2-12 раз, при этом увеличиваются сроки использования живртных, получают более высокотитражные сыворотки, которые используют для производства диагностических и лечебных препаратов ° 1 з,п. ф-лы. русную суспензию тщательно пипетируют, центрифугируют на холоду при

2000 об/мин и надосадок вносят в колонку из расчета 1/4-1/5 объема столба МПС. После того, как вирус" ная суспензия входит в MIIC в колонку вносят буфер и при скорости

0,6 мл/см /мин собирают элюаты в

3 мерные пробирки по 2 мл. В каждом элюате определяют титр вируса. Элюаты с высоким содержанием гемагглютинирующей активности объединяют с учетом, что объем смеси элюатов не превышает 1/4-1/5 объема столба

МПС. Таким образом, получают необходимый объем очищенной вирусной суспензии и определяют титр вируса, который, как правило, не отличается от титра вирусной суспензии до очи" стки.

Очищенную вирусную суспензию инактивируют ультрафиолетовым облучением лампой БУФ-30 на расстоянии

17 см 30 мин при периодическом перемешивании.

Очищенный инактивированный вирус с титром 1:8000 ГА/0,2 мл совместно (в одном шприце) с 2,7 мг трипсина и 5,4 мг поливинилового спирта (весовое соотношение трипсин:поливиниловый спирт 1:2) в объеме 1 мл

0,15 М раствора хлористого натрия вводят подкожно (в область задней конечности) однократно белым беспородным крысам массой 150-200 г.

Лабораторным животным контрольной группы вводили соответствующую дозу вируса с максимальным количеством поливинилового спирта.

Каждая группа состоит из семи лабораторных животных. В день иммунизации и затем на 14, 28, 35 и 42 дни производят забор крови из хвостовой вены крыс. В полученных из крови сыворотках определяют антигемагглютинирующую активность в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Перед постановкой РТГА для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации сыворотки обрабатывают риванолом. Для этого к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,4 мл 0,4Х-ного раствора риванола (рН 7,-2-7,4), встряхивают о и оставляют на 20 мин при 4 С. Выпавший осадок удаляют центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин. К надосадочной жидкости добавляют хлористый натрий из расчета 20 мг на пробу и помещают на 18 ч в холодиль1 1301409

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для производства диагностических и лечебных сывороток.

Цель изобретения — пролонгирование повышенных титров антител.

Пример 1. Для получения вирусосодержащей жидкости используют

10-11-дневные куриные эмбрионы„ в аллантоисную полость которых вводят 10 по 0,2 мл аллантоисной культуры вируса гриппа А (Гонконг/1)68(Н3112) в

-э разведении 10 -10 . Эмбрионы после заражения инкубируют 48 ч в термостате при 36-38 С. По истечении срока 15 инкубации эмбрионы охлаждают 18 ч при 4 С или 2-3 ч при -20 С. Аллантоисную жидкость из зараженных куриных эмбрионов отсасывают и исследуют в реакции гемагглютинации с 20

IХ-ной взвесью эритроцитов кур, Для этого готовят двукратные падающие разведения вируса на физиологическом растворе хлористого натрия в объеме 0,2 мл и после этого в каждое разведение добавляют по 0,2 мл

О,IХ-ной взвеси эритроцитов кур ° Реакцию ведут при комнатной температуре и учитывают после полного оседания эритроцитов. За титр вируса 30 принимают наибольшие разведения, дающие четко выраженную агглютинацию.

Аллантоисную вирусосодержащую жидкость центрифугируют на холоду в центрифуге ЦЛР-1 при 5000 об/мин

20 мин для удаления механических примесей. Осадок отбрасывают, а надосадок центрифугируют на холоду в центрифуге ЦВР-I при 20000 об/мин 40

1,5 ч, чем достигают концентрирование вируса, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в

:охлажденном физиологическом растворе и разводят до титра l:8000-1:

:16000 ГА/0,2 мл.

Очистку вирусной суспензии проводят методом фильтрационной хроматографии на колонках с макропористым силохромом (МПС).

Колонку с МПС (16 см « 2 см) промывают 0,05 M трис-НСI-бстфером (три-оксиметил-аминометан) на 0,15 М растворе хлористого натрия (рН буфера 7,2-7,4) до тех пор пока выходящая из колонки жидкость не соответствует этому значению рН. Уровень буфера в колонке уравнивают по нижнему мениску с уровнем МПС. Ви1301409

При этом титры антигемагглютиниов на 21-42 дни в 2,5-5,7 раз выше, ем при известном способе.

Пример 6. Последовательность

ыполнения операций аналогична приеру 1-. Невозможно осуществлять спооб при весовом соотношении трипсин:

:поливинилпирролидон 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5).

Увеличивать количество поливиилпирролидона больше соотношения

1:20 нецелесообразно из-за вязкости бразующегося раствора.

Пример -7. Последовательность

ыполнения операций аналогична приеру 1. Осуществляют способ при исользовании полиэтиленгликоля. Весовое соотношение трипсин:полиэтиленгликоль 2,7 мг:5,4 мг (1:2), На

28, 35, 42 дни наблюдения титры антигемагглютининов в опытной группе соответственно в 2,6-10,6 раз зыше, чем при известном способе.

Пример 8. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:полиэтиленгликоль 2,7 мг:54 мг (1:20), На

28, 35; 42 дни наблюдения титры антигемагглютининов в опытной группе соответственно в 3, 12, 1 раз выше, чем при известном способе, Пример 9. Последовательность выполнения операпий аналогична примеру 1, Невозможно осуществлять способ при весовом соотношении трипсин:полиэтиленгликоль 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5) .

Увеличивать количество полиэтиленгликоля больше нецелесообразно из-за увеличения вязкости раствора, Таким образом, предлагаемый способ получения противогриппозных антител дозволяет повысить титры специфических антител в сыворотках крови животных-продуцентов в .2-12 раз, причем на более длительных сроках после иммунизации (28-42 дни) наблюдается увеличение титров антител в 3-12 раз. Это позволяет увеличить сроки использования животных и при этом получать более высокотитражные сыворотки, и может быть использовано для производства диагностических H лечебных препаратов, а также в практике научных исследований.

3 ник. Надосадочную жидкость после центрифугирования используют для н постановки РТГА, для чего применя- ч ют микротитратор "Такат" °

Двукратное разведение сыворотки 5 в готовят на 0 15 М растворе хлористо- м

:ro натрия перекаткой петлями объемом с

/ О, 025 мл. Раб оч е е разведение одноименного вируса А(Гонконг/1)68 содержит четыре гемагглютинирующие еди-fg ницы. К каждому разведению сыворотки н добавляют равный объем рабочего разведения вируса. Смесь встряхивают о и 30 мин выдерживают при комнатной температуре, а затем в лунки добавля-15 в ют двойной объем 0 57-ной взвеси ку- м ф О риных эритроцитов, Из полученных п результатов рассчитывают средние гео-, метрические титры антител и достоверность различий, Они свидетельству-Zp ют о том, что в более поздние сроки наблюдения (на 28-42 дни) средние геометрические значения антигемагглютинирующей активности в опытной группе в 2, 8, 7, 5 раз выше, чем при известном способе.

Пример 2. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:поливиниловый спирт 2,7 мг:54 мг (1:20).

При этом титр антигемагглютининов на

28-42 дни в опытной группе в 3 2-9,2 раз выше, чем при известном способе.

Пример 3. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:поливиниловый спирт 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5).

Увеличивать количество поливини- 40 лового спирта больше соотношения

1:20 нецелесообразно. из-за вязкости образующегося раствора.

Пример 4. Последовательность выполнения операций аналогична при- 45 меру l. Осуществляют способ при использовании поливинилпирролидона, Весовое соотношение трипсин:поливинилпирролидон 2,7 мг:5,4 мг (1:2).

Титры антигемагглютининов на 2842 дни в опытной группе в 2,610,6 раз выше, чем при известном способе, Пример 5. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при использовании поливинилпирролидона.

Весовое соотношение трипсин:поли-. винилпирролидон 2,7 мг:54 мг (1:20) °

5 1301409

Ф о р м у л а и з обретения

1. Способ получения противогриппозных антител путем иммунизации животных инактивированным вирусом гриппа, отличающийся тем, что, с целью пролонгирования повьпденных титров антител, иммунизацию вирусом осуществляют совместно с раствором, содержащим трипсин и водорастворимый полимер при весовом соотнощении соответственно 1:2-1:20.

2, Способ по и, 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве водорастворимого полимера используют поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль.

Составитель П, Бонарцев

Редактор И.Горная Техред М.Ходанич Корректор С.Шекмар

Заказ 1172/4

Тираж 596 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4