Способ определения цистеин-содержащих белков

Способ определения цистеин-содержащих белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Для упрощения способа белки разделяют диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, затем гели погружают на 8-12 мин в 6,9-10,9%-ный раствор плюмбита калия и инкубируют в том же растворе 8-12 мин на кипящей водяной бане. Для фиксации окраски и сохранения структуры гелей их в.ьщерживают 12-18 мин в 5-10%-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин. Гели денситометрируют в проходящем свете. 1 табл. оо о ю со СП

СО1ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 6 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A BTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

00 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3671366/28-14 (22) 08.12.83 (46) 07.04.87. Бюл. 9 13 (71) Ростовский государственный уни.верситет им. М.А. Суслова (72) А.А. Синичкин, В.А. Лепехин и Б.И. Сумряков (53) 612.015(088.8) (56) Analytical Biochemistry, 1973, ч. 51, У 2, р. 466-469.

SU 1302195 А 1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ11ИЯ ЦИСТЕИНСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ (57) Для упрощения способа белки разделяют диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, затем гели погружают на 8-12 мин в 6,9-10,9%-ный раствор плюмбита калия и инкубируют в том же растворе 8-12 мин на кипящей водяной бане. Для фиксации окраски и сохранения структуры гелей их выдерживают 12-18 мин в 5-10%-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин.

Гели денситометрируют в проходящем свете. 1 табл.

1302195

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения цистеинсодержащих белков при электрофорезе в полиакриламидном геле. 5

Цель изобретения — упрощение способа за счет сокращения числа стадий.

Способ осуществляется следующим образом.

Анализируемые белки разделяют !

О диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, затем гели извлекают из трубок и погружают на 8-12 мин в

6 9-10 9%-ный раствор плюмбита калия о

15 после чего в том же растворе инкубируют 8-12 мин на кипящей водяной бане. При этом в зонах цистеинсодержащих белков проявляются черные полосы сульфида свинца. Для фиксации окраски и сохранения структуры

20 гелей их выдерживают 12-18 мин в

5-lOX-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин. Через 24 ч глицерин необходимо сменить. Для длительного

25 сохранения окраски гели хранят в герметически закрытой посуде в глицерине в прохладном темном месте.

П p и м е р 1. Приготовление аналитического реагента для идентификации цистеинсодержащих белков раствора плюмбита калия.

К IOX-ному раствору ацетата свинца постепенно приливают при перемешивании насыщенный раствор едкой щелочи (KOH) ; При этом выпадает белый осадок гидроокиси свинца. Щелочь приливают до полного растворения осадка. Вместо ацетата свинца можно использовать другие растворимые в воде соли свинца, а вместо едкого калия — едкий натр.

Идентификация индивидуального цистеинсодержащего белка, а именно сывороточного альбумина быка, при разделении диск-электрофорезом в полиакриламидном геле.

5 мкл водного раствора, содержащего !О мкг сывороточного альбумина быка, подвергают диск-электрофорезу в 7,5%-ном полиакриламидном геле.

Для диск-электрофореза используют стеклянные трубки с внутренним диаметром 3 мм и длиной 70 мм. После диск-электрофореза гели извлекают из

55 трубок и помещают в раствор плюмбита калия на 10 мин при комнатной температуре, затем в том же растворе гели инкубируют 10 мин на кипящей водяной бане, ополаскивают дистиллированной водой, выдерживают 15 мин в 7%-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин. При этом в гелях появляются черные полосы в зонах альбумина и его димера. Гели денситометрируют в проходящем свете на микроденситометре.

Построение калибровочной кривой.

Для определения количества цистеина в зонах цистеинсодержащих белков строят калибровочную кривую по сывороточному альбумину быка. Для этого подвергают диск-электрофорезу образцы, содержащие соответственно 10,20, 40,60,80 и 100 мкг сывороточного альбумина быка„ После диск-электрофореза гели обрабатывают, как описано.

После денситометрирования гелей денситограммы вырезают и обрабатывают гравиметрически. Зная количество альбумина в образцах и содержание в альбумине цистеина (5,17%), строят калибровочную кривую, отражающую зависимость массы денситограмм от количества цистеина в зоне. По калибровочной кривой можно определить количество цистеина в зонах цистеинсодержащих белков, а также количество самих белков, если известно содержание в них цистеина.

Пример 2. Индентификация цистеинсодержащих белков сыворотки крови крыс при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле.

5 мкл сыворотки крови крыс подвергают диск-электрофорезу в

7,5%-ном полиакриламидном геле. После диск-электрофореза гели обрабатывают, как описано. После денситометрирования гелей денситограммы вырезают и обрабатывают гравиметрически.

Цистеинсодержащие белки индентифицируют в зонах альбумина, гемоглобина и иммуноглобулинов в виде интенсивных черных полос. По весу денситограмм при помощи калибровочной кривой определяют содержание цистеина в зонах и количество альбумина в образце.

В таблице представлены данные, отражающие содержание цистеина в зонах цистеинсодержащих белков сыворотки крови крыс.

Согласно полученным данным содержание мономерной формы альбумина в

5 мкл сыворотки крови крыс составляет 42 мкг или 840 мг%.

13021

Гемоглобин

Т-гло— булиАльбумин

Показатели ны

Масса денситограмм, мг 9,2

1,4

4,1

Масса цистеина в зонах, мкг

0,52

2,12!,0

Масса белка в зонах, мкг 42

- 15

Формула изобретения

Составитель Н. Гуляева

Редактор О. Юрковецкая Техред И.Попович

Корректор С. Шекмар

Заказ 1212/44 Тираж 777

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подлисное

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 3. Определение оптимальных режимов обработки гелей.

Оптимальный диапазон концентраций плюмбита калия в растворе составляет

6,9-10,97. Масса площади пика денси- 20 тограммы для эоны альбумина,нанесенного в количестве 40 мкг на гель при обработке раствором плюмбита калия в концентрациях .6 9 8,6 и 111,97, составляет соответственно 9,2+18; 25

9,0+0,20; 9,1+0,23 мг.

Выдерживание геля в растворе плюма бита калия при 25 С оптимально в течение 8 — 12 мин. Масса площади пика на денситограмме (40 мкг альбумина 30 на гель) при,инкубации геля в течег

95 4 ние 8,10 и 12 мин при 25 С составляет соответственно 7,0+0,12; 7,0+0,14 и 7,1+0,15 мг (значения при отсутствии дальнейшего выдерживания на кипящей водяной бане).

Выдерживание геля в растворе плюмбита калия при кипячении на водяной бане оптимально в течение 8-12 мин.

Масса площади пика на денситограмме (для 40 мкг альбумина на гель) при инкубации геля в течение 8, 10 и 12 мин при кипячении на водяной бане составляет соответственно 9,0+0,2; 9,1+0,2 и 9,1+0,25 мг.

Способ определения цистеинсодержащих белков путем разделения анализируемых белков диск-электрофорезом в полиакриламидном геле с последующей обработкой геля окрашивающим реагентом и денситометрированием, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа стадий, в качестве реагента используют плюмбит калия в концентрации 6,9-10,9Х,выдерживают гель в этом растворе 8 — 12 мин, а затем 812 мин на кипящей водяной бане.