Насадка для жидкостной хроматографии

Насадка для жидкостной хроматографии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к насадкам для жидкостной хроматографии. Насадка позволяет проводить высокоскоростное разделение и анализ веществ, обеспечивает разделение смеси белков при скорости потока 0,5-2 мл/мин в течение 10-20 мин (степень извлече-. кия белков 90-100%). Насадка представляет собой водный гель сшитого сополимера винилового спирта (ВО), винилацетата (ВА) или винилпропионата (ВП) и триаллилизоцианурата (ТАИЦ) при молярном соотношении звеньев а/а+ + b 0,4-0,8 и 3 с/а + b + 3 с 0,25-0,4, где а, b и с - молярные отношения соответственно звеньев ВС, ВА или ВП и ТАЩ к общему числу звеньев в сополимере, при среднем диаметре частиц геля 4-198 мкм, максимальном диаметре пор в них, соответствующем молекулярной массе полизтиленгЛиколя или декстрана, равной 1,910 - 1,010, при котором молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц геля, и содержании воды в геле 100-198 мае.ч. на 100 мае.ч. сшитого сополимера. 1 табл. О) оэ со см

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3303096/23-05 (22) 24.06.81 (31) 85243/1980; 183703/1980 (32) 25.06.80; 26.12.80 (33) JP (46) 15.05.87. Бюл. У 18 (71) Асахи Касеи Когио Кабусики

Кайся (JP) (72) Юзо Янагихара, Кохдзи Ногути и Макото Хонда ()Р) (53) 543.544.42(088.8) (56) Патент Великобритании Ф 2034328, кл. С 08 Р 8/12, 1980. (54) НАСАДКА ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ XPONATOГРАФИИ (57) Изобретение относится к насадкам для жидкостной хроматографии. На- садка позволяет проводить высокоскоростное разделение и анализ веществ, обеспечивает разделение смеси белков при скорости потока 0,5-2 мп/мин в

„„SU„„1 11631 АЗ (594G01N 3048 СО Ь 2 04 течение 10-20 мин (степень извлече-. ния белков 90-100K). Насадка представляет собой водный гель сшитого сополимера винилового спирта (ВС), винилацетата (ВА) или виннлпропионата (ВП) и триаллилизоцианурата (ТАИЦ) при молярном соотношении звеньев а/а+

+ b = 0,4-0,8 и 3 с/а + b + 3 с

0,25-0,4, где а, Ь и с - молярные отношения соответственно звеньев ВС, ВА или ВП и ТАИЦ к общему числу звеньев в сополимере, при среднем диаметре частиц геля 4-198 мкм, максимальном диаметре пор в них, соответствующем молекулярной массе полиэтиленгликоля или декстрана, равной

1,9 10 — 1,0 10, при котором молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц геля, и содержании воды в геле 100-198 мас.ч. на 100 мас.ч. сшитого сополимера. 1 табл.

1311631

Изобретение относится к методам хроматографического анализа, в частности к насадке для жидкостной хроматографии (ЖХ), и может быть использовано в области биохимии и медицины для высокоскоростного и высокоэффективного разделения или анализа веществ, растворенных в растворителе, в соответствии с механизмом разделения гельпроникающей хроматографии (ГПХ).

Цель изобретения — обеспечение пригодности насадки для высокоскоростного разделения и анализа веществ.

Предлагаемый гель получают омыпением сшитых сополимеров винилацетата (BA) или винилпропионата (ВП) с триаллилизоциануратом (ТАИЦ) . Отношение а а+Ь вЂ” = у.характеризует степень омыления сополимера (т.е. количество гидроксильных грунп) и гидрофильность геля.

Коэффициенты м и Ь рассчитываются по плотности гидроксильных групп (qOH) н геле и количеству звеньев

ТАИЦ, qOH обозначает эквивалент звеньев ВС на весовую единицу геля и может быть определено путем реагиро-. вания геля с уксусным ангидридом в пиридиновом растворителе, при этом измеряется количество израсходованного уксусного ангидрида в реакции с гидроксильными группами или изменение веса геля и рассчитывается концентрация гидроксильных групп по этой измеренной величине. Например, 1 ммоль уксусного ангидрида израсходован в реакции с 1 г сухого геля, qOH этого геля — 1 миллиэквивалент/г.

Количетсво ТАИЦ определяется по содержанию азота, полученного с помощью элементарного анализа геля.

Другими словами, а можно получить по

qOH, а Ь вЂ” по величине, полученной путем вычитания общего количества звеньев ВС и ТАИЦ из общего количества звеньев в сополимере соответственно.

3с

Отношение †- — = х характеа+Ь+ Зс ризует степень сшивки сополимера.

Коэффициенты ц и Ъ определяются по указанному мтеоду, à C — по значениям элементарного анализа геля или путем расчета по молям ВА и ТАИЦ, которые поставляются вместе (а + b) и с, в указанной формуле.

Когда Х находится в указанном диапазоне, гель с частицами небольшого размера имеет достаточную прочность для выдержнвания высокого давления

5 и высокой скорости. Такой гель также обладает достаточной гидрофильностью и плохо адсорбирует компоненты в вод.ном растворе, в частности протеины и аминокислоты, что повышает целесообразность er î использования в высокоскоростной ГПХ.

Количественный состав насадки (100 вес.ч. сополимера и 100-198 вес.ч. воды) характеризует степень набухания геля — W„, которая соответственно находится в пределах 1,0-1,98 г воды/г сухого геля.

W определяется следующим образом.

Гель, погруженный в воду и полностью в уравновешенном состоянии, центрифугируется для удаления воды, прилипшей к поверхности геля, и измеряется его вес (W,). Гель просуши-. вается и определяется его сухой вес (W ). W рассчитывается по формуле

W l W2

ы

Предлагаемый гель характеризуется максимальным размером пор в частицах геля, соответствующим молекулярному весу полиэтиленгликоля или декстрана, равному 1,9,.10 — 1,0 10, при кото-Ы ром молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц геля.

Вещества с молекулярным весом ниже критической величины могут разде ляться с помощью ГПХ, а вещества с

4 более высоким молекулярным весом по сравнению с критической величиной не могут проникнуть в поры геля, а проходят непосредственно через зазоры в геле. Следовательно, эти вещества дают тот же объем элюирования, несмотря на молекулярный вес, и, следовательно, не могут разделяться с помощью ГПХ..

М ;щ может определяться по калибровочной кривой ГПХ, которая может быть получена путем построения графика логарифмов молекулярных весов отдельных образцов, молекулярный вес которых складывается на ординате, а

55 объем элюирования каждого образца— на абсциссе относительно набитой гелем колонне.

График на фиг.1 показывает зависимость между объемом элюирования. 1311631 4 е- имеющую мелкие поры, равномерно рася пределенные во внутренних частях чася, тиц. Органические синтетические полимеры, имеющие сшитую структуру, разу 5 бухают в растворителе, имеющем сроде . ство с этими полимерами, и дают усадку при сушке. При использовании мягы кого геля поры, заполненные растворителем при разбухании, поддерживаются ре- 10 только сшитой сеткой. Такая стека не ь- . поддерживается в разбухшем состоянии но и, следовательно, гель дает усадку и по- большая часть пор исчезает. В этом

ый случае удельная площадь поверхности становится по существу величиной нае ружной поверхности частиц и имеет в а, общем очень низкую величину — менее о 1 м /г. При использовании твердого геля с твердой пористой структурой ву 20 после сушки геля поры могут поддерживать по существу то же состояние, о- что в момент разбухания, хотя они дают незначительную усадку (т.е. поры имеютпостоянный характер .Следовательно, твердый гель имеет удельную площадь поверхности, которая намного больше по сравнению с мягким гелем.

Обычно предлагаемый гель имеет ,й удельную площадь поверхности (S) при- ю мерно 5-1000 м /г. Если гель имеет ть удельную площадь поверхности меньше нижнего предела диапазона, это означает, что гель имеет структуру одно- ся родного типа (мягкий гель), которая о- 35 вряд ли содержит мелкие поры и поэтому е- не пригодна для высокоскоростной ГПХ. ее Удельная площадь поверхности определяется по способу ВЕТ с исполья зованием газообразного азота. о Предлагаемый гель обычно имеет средневесовой диаметр части (D ) прии- мерно 4-198 мкм. В частности, наибо1- лее благоприятные характеристики для

ЖХ гель имеет тогда, когда D имеет с- небольшое значение, например в диапано зоне примерно 5-20 мкм. Когда требуется высокая разделяющая способность, П геля должна быть в диапазоне прие- мерно 5-12 мкм. D измеряется с по50 мощью счетчика Коултера и рассчитыда вается по формуле,« (т ;- d; )

5 (n; ñ1 ; ) (V) в миллилитрах и молекулярным в сом материала, предназначенного дл разделения. Наклонная линия и лини параллельная ординате, на этом гра фике представляют собой по существ прямые линии. Часть, на которой дв линии пересекаются, называется кри вой. M . .выражается в виде величин

1jm на ординате в точке, в которой про должение наклонной прямой линии пе секает продолжение линии, параллел ной ординате. М<,. представляет од свойство, которое присуще гелю, и казывает исключительный молекулярн вес, при котором гель может оказывать разделяющее действие на основ различия размеров молекул. Веществ имеющие больший молекулярный вес п сравнению с исключительным молекулярным весом, элюируются по сущест . вместе без разделения.

M О. определяется путем использ

Ьm вания в качестве эталона веществ, имеющих известный молекулярный вес полиэтиленгликолей или декстранов, и дистиллированной воды в качестве растворителя. Поскольку поставляем промьппленностью водорастворимые ст дартные полимеры имеют молекулярнь вес меньше примерно 2000000, полну калибровочную кривую нельзя получи по гелю, имеющему М ;„,, превышающе

2000000. Поэтому Мр;„„ такого геля точно не определяется, а оценивает по точке пересечения, в которой пр должение калибровочной кривой, опр деленное по молекулярным весам мен

2000000, пересекает продолжение ли нии, параллельной ординате, котора определяется при тех же условиях п гелю, имеющему меньший М ;, Для того, чтобы гель имел механ ческую прочность, пригодную для вь сокоскоростной ГПХ, в сочетании с отсутствием адсорбционной способно ти, степень сшивки Х предпочтитель должна быть в диапазоне примерно . О, 25-0, 32, когда М „„, находится в диапазоне примерно 10 — 10, и ст

5 пень сшивки предпочтительно должна составлять примерно 0,27-0,35, ког

Мр находится в диапазоне примерно

10 — 1O .

Предлагаемый гель является полностью пористым твердым гелем, имеет

55 большую удельную площадь поверхности в сухом состоянии. Полностью пористая структура означает структуру, где d; — диаметр частиц;

n. — частота частиц с диаметром

cl ) °

Тип со полиме

3.10

10 1,58

9,5 1,0

0,64

0,25

38 1,9.10

8 ° 10

0,74

0,25

9, 1 1,46

52

0,72

0,29

10,8 1,3

12, 1 1,78

9,7 1,5

11,4 1,65

5 ° 10

0,62

5 10

0,47

0,33

2 .10

1 10

11,8 1,85 120

1.10

Ф!

14,5 1,98

4,0 1,23

0,28

2.10

В жидкостной хроматографии ра.зделяющая способность может быть повышена за счет уменьшения размера частиц набивки. Однако при пропускании растворителя через колонну, набитую гелем с частицами меньшего размера, значительно возрастают потери давления по сравнению с гелем, имеющим большие размеры частиц. Следовательно, при небольшой механической прочности геля гель деформируется или разрушается, вызывая ненормально большие потери давления, что делает невозможным СЖХ при использовании геля с малыми размерами частиц. Так как механическая прочность предлагаемого геля может быть значительно улучшена за счет регулирования различных свойств, включая число о!жытения и степень сшивания, гель может выцержи- >О вать высокие скорости и давления, несмотря на маленький размер частиц.

Размер пор предлагаемого геля может регулироваться в широком диапазоне, поэтому гель может применяться

25 не только для разделения или анализа водорастворимых полимеров сахаридов или протеинов, а также для анализа компонентов с молекулярной массой в несколько сот тысяч и миллионов, которые присутствуют в крови и моче, которые тесно взаимосвязаны с болеэ"

1 б нями почек или печени или симптомами, например карцином. Поскольку предлагаемый гель обладает такими же высокими характеристиками, как гель для высокоскоростной ГПХ, эти анализы могут. выполняться в течение короткого периода времени с получением большего количества информации.

Предлагаемый гель используется в виде насадки колонны. Используемая колонна обычно представляет собой цилиндр, изготовленный из нержавею" . щей стали, но в зависимости от назначения может быть выбрана любая дру-. гая колонна.

Пример ы 1-19. Гели .сшитого сополимера ВС с ВА и ТАИЦ (А) или

ВС с ВП и ТАИЦ (В) помещают в качестве набивки в колонну из нержавеющей стали даиметром 7,5 мм и длиной 50 см.

Характеристические показатели применяемых гелей (Х, У, Ъ, M<, S и И . ) определяют по описанным ме-! !!! тодикам. Определение Мр;„„ проводится на водном растворе декстранов и полиэтиленгликолей с использованием детектора дифференционного рефрактора

1Подекск R 1, модель 8 Е-11, насоса и инжектора модели 635А.

Показатели применяемых гелей сведены в таблицу.

1311631

Продолжение таблицы

1 10

20,0 1,95

19,8 1,9

10,4 1,21

11,0 1,10

0,28

0,78

0,7

1 .10

0,28

2 10

0,4

0,29

1,9 ° 10

0,8

0,25

Сравнительные

9,7 1,95

0,98

0,25

9,0 1,25

14,8 3,31

9,2 1,4

10,1 1,96

0,33

0,25

0,1

0,017 0,9

0,61

0,6

0,78

0,1

М. определяется по полиэтиленгликолю, в остальных примерах - по

К! М декстрану.

На колонне с насадкой согласно примеру 1 проводился анализ у-глобулина, алюбумина бычьей сыворотки, овалюбумина и миоглобулина с использованием в качестве растворителя водного раствора, содержащего 0,3 М хлорида натрия и 0,1 М фосфата натрия, а также детектора ультрафиолетового спектра поглощения. Протеины элюировались по порядку, при этом выход протеина с большим молекулярным весом составил по существу 100Х. Измеренйе всех образцов проводилось при скорости потока 1 мл/мин.

1 роме того анализировалн раствор 45 образца сублимированной человеческой сыворотки, получаемая хроматограмма представлена на фиг.2, на которой пик А в основном показывает алюбумин, пик  — креатинин и пик С вЂ” мочевую . 50 кислоту. Некоторые компоненты были. элюированы в большем количестве по сравнению со свободным объемом колонны в связи со слабой абсорбционной способностью геля, но ряд компонентов был обнаружен и выделен после элюирования ъ -глобулина и алюбумина.

На колонке с насадкой согласно примеру 2 проводили анализ образца сублимированной человеческой сыворотки. Полученная хроматограмма представлена на фиг.3, где пик D показывает в основном алюбумин, пик Е— креатинин, а пик F — мочевую кислоту.

Число пиков меньше по сравнению с фиг.2 вследствие низкой чувствительности измерений. Основная картина кривой элюирования такая же, как на фиг.2. Следовательно, с помощью геля этого примера можно обнаружить и отделить ряд компонентов.

На колонке с насадкой согласно примеру 5 проводят анализ стандартных образцов алюбумина бычьей сыворотки, овалюбумина и миоглобулина.

Полученная хроматограмма представлена на фиг.4, где кривая G показывает кривую элюирования алюбумина, кривая

Н вЂ” кривую элюирования овалюбумина и кривая I — кривую элюирования миоглобулина.

Результаты показывают, что гель этого примера очень эффективен для отделения протеинов. Измерения на всех образцах проводились при скорости потока 1 мл/мин, каждый анализ проводился в течение 20 мин.

1311631

Иа колонке с насадками согласно примерам 3-4, б-14 также проводили анализ протеинов, включая -глобулин, яичный альбумин, овалюбумин и миоглобулин. Анализ проводился при скорости потока 0,5-2 мп(мин в течение

10-20 мин. Полученные хроматограммы показывают элюирование белков в по" рядке возрастания молекулярных весов, степень извлечения белков 90-1007. 10

На колонке с гелями согласно сравнительным примерам 15-19 проводили анализ г-глобулина и альбумина бычьей сыворотки, овалюбумина и миоглобулина. Однако вследствие недостаточной прочности геля и больших потерь давления в колонке и почти полной абсорбции на геле белков пики элюирования на хроматограммах не были обнаружены. 20

Как следует из примеров, предлагаемая насадка обеспечивает высокоскоростное разделение и анализ веществ методом гельпроникающей жидкостной хроматографии, Формула изобретения

Насадка для жидкостной хромато" графии на основе водного геля сшитого гидроксилсодержащего сополимера, о т л и ч а ю щ а ÿ с я тем, что, .с целью обеспечения пригодности насадки для высокоскоростного разделения и анализа веществ, она содержит в качестве сшитого гидроксилсодержащего сополимера сополимер винилового спирта с винилацетатом или винилпропионатом и триаллилизоциануратом при молярном отношении звеньев а/а + Ь

= 0,4-0,8 и Зс/а + b + Зс = 0,25-0,4, где а, Ъ и с — молярные отношения соответственно звеньев винилового спирта, винилацетата и винилпропионата и триаллилизоцианурата к общему числу звеньев в сополимере, при среднем диаметре частиц геля 4-198 мкм и максимальном диаметре пор в них, соответствующем молекулярной массе полиэтиленгликоля ипи декстрана, равной

1,9 10 — 1,0-10, при котором молекулы этих полимеров не проникают в поры частиц геля, при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:

Сшиты@ сополимер 100

Вода 100-1 98

Приоритет по признакам:

25. 06.80 — применение для насадки водного геля сшитого сополимера с определенным по формуле размером частиц, диаметром пор и содержанием воды;

26. 12,80 -. применение для насадки водного геля сшитого сополимера с определенным по формуле молярным отношением звеньев сомономеров:.

1311631

131 l 631

Составитель В.филимонов

Техред Л.Олейник Корректор А.Ильин

Редактор N.Ïåòðîâà

Эаказ 1907/58 Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 t3035, Москва, Ж"35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4