Способ получения иммобилизованных гидролаз 0-гликозильных соединений

Способ получения иммобилизованных гидролаз 0-гликозильных соединений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения иммобилизованных на твердых носителях ферментов. Цель изобретения - увеличение ферментативной активности иммобилизованных гидролаз и ускорение процесса . Иммобилизацию осуществляют в перфорированном контейнере, заполненном пористым кремнеземом с толщиной слоя гранул 40-200 мм. Реагенты направляют рециркуляцией душированием через слой. Скорость рециркуляции реагентов 40-220 л/мин на 1. м сечения. При расходе реагентов 1-5 л на 1 кг носителя отдельные процессы активации и иммобилизации осуществляют в течение 0,1-2,0 ч. Данным способом иммобилизованы грибная р -галактозидаза, дрожжевая инвертаза и другие гидролазы. 5 табл. i СЛ со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

Ai (19) (11) (51) 4 - С 12 Н 11/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3873154/31-13 (22) 02.04.85 (46) 15.06,87, Бюл. 1(22 (71) Таллинский политехнический институт и Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (72) М.О, Мандель, Е,И. Христофоров, Н.М, Самошина и Л.А. Нахапетян (53) 5?7.15(088,8) (56) Иммобилизованные ферменты. Под ред, И.В. Березина и др. М.: МГУ, 1976, т,2, с,282-283, Авторское свидетельство СССР

К - 608804, кл. С 12 N 11/04, 1976. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ГИДРОЛАЗ О-ГЛИКОЗИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ (57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения иммобилизованных на твердых носителях ферментов.

Цель изобретения — увеличение ферментативной активности иммобилизованных гидролаз и ускорение процесса, Иммобилизацию осуществляют в перфорированном контейнере, заполненном пористым кремнеземом с толщиной слоя гранул 40-200 мм. Реагенты направляют рециркуляцией душированием через слой, Скорость рециркуляции реагентов 40-220 л/мин на 1 м а сечения. При расходе реагентов 1-5 л на 1 кг носителя отдельные процессы активации и иммобилизации осуществляют в течение 0,1-2,0 ч, Данным спо- д собом иммобилизованы грибная P -галактозидаза, дрожжевая инвертаза и другие гидролазы. 5 табл.

1 .13170

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения иммобилизованных на гранулированных твердых пористых материалах ферментов, в том числе к осуществлению про- g цессов активации носителя и связывания ферментов с ним, и может найти применение в микробиологической промышленности при производстве иммобилизованных ферментов, в частности 1р иммобилизованных грибной Р -галактозидазы, дрожжевой инвертазы, бактериальных с — и глюкоамилазы и др.

Цель изобретения — увеличение фер- 15 ментативной активности целевого продукта и ускорение процесса, Изобретение заключается в том, что .процесс иммобилизации гидролаз

0-гликозильных соединений проводят в перфорированном контейнере, Перфорированный контейнер является конусным сосудом, стенки и дно которого покрыты перфорированным материалом для удерживания гранулированного носителя и не создающего заметного гидI равлического сопротивления при движении растворов через слой гранул, В ходе рециркуляции растворов обра- . зуется на поверхности слоя гранул 30 слой жидкого реагента, высота которого зависит от скорости притока реагента, 3а счет действия капиллярных сил и водопроницаемости упакованного в контейнере пористого материала, жидкие реагенты контактируют с носителем, более эффективно, По своим техническим показателям контейнер приближается к реактору с фильтрующим дном, однако в перфори- 40 рованном контейнере активно работают также стенки, которые способствуют эффективному перемещению жидкости в межгранульном пространстве. Эффективность движения жидкости в перфорированном контейнере можно сравни" вать с перемешиванием в реакторе„

Таким образом, контейнерный метод иммобилизации на гранулированные материалы ферментов имеет следующие преимущества: увеличивается эффективность и интенсивность контактирования реагентов с носителем, которые отражаются в увеличении активности препаратов и сокращении времени проведения процесса, а также уменьшаются потери носителя за счет отсутствия

его механического разрушения, имеющего место в реакторах перемешивания, 24 г в том числе в дражирователе, В пер= форированном контейнере упакованный носитель не требует многократной пе-, регрузки в ходе многоэтапной иммобилизации, Использование душевого устройства позволяет создавать равномерный слой реагента по всей поверхности носителя и обеспечивает рециркуляцию реагентов с нужной скоростью, Ускорение процесса иммобилизации с сохранением высокой активности целевого продукта может быть достигнуто при заполнении контейнера слоем пористого кремнезема толщиной 40220 мм и пропускании реагентов со скоростью 40-220 л/мин на 1 м в те2 чение 0,1 — 2,0 ч (при расходе реагентов 1,0 — 5,0 г на 1 кг носителя).

По сравнению с известным способом достигается уменьшение времени процесса иммобилизации на 1 ч, а также увеличение активностей иммобилизованных ферментов в 8-200 раз.

Способ иллюстрируется следующими примерами„

Пример ы 1-3. В перфорированные контейнеры (размеры и другие данные указаны табл,l) загружают

0,45 кг (пример 1), 1,0 кг (пример 2) или 2,4 кг (пример 3) сухого силикагеля С-80 с размерами частиц 0,30,5 мм, диаметром пор 40-60 нм и удельной поверхностью 80 м /г, Высота слоя гранул 75 мм, 125 мм или

180 мм соответственно, Через слой гранул пропускают 0,1 М ацетатного буфера рН 4,6 для пропитывания пор гранул буфером, Затем пропускают

0,9 л, 2,2 л или 5 5 л ферментного раствора, имеющего исходную активность 175 E/ìë со скоростью рециркуляции 4,0 л/мин, За единицу активности P — галактозидазы принято такое количество фермента, которое образует в 57-ном растворе лактозы

1 мкмоль продуктов за l мин при рН

4 б и 30 С, Кинетика адсорбции Р --галактозидазы на силикагель С-80 представлена в табл,l откуда видно, что она практически заканчивается за 30 мин, После кантактирования фермента с носителем полученный комплекс обрабатывается 1Х-ным водным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН 6,85, При скорости рециркуляции 4,0 л/мин процесс про3 131 должается 45 мин, Объемное соотношение реагента и влажного носителя

1,5 л/кг. Иммобилизованная Р "галактозидаза очищается от следов реагента и фермента, которые не принимают участие в. реакции, проточной промывной водой со скоростью 3 л/мин в течение 15 мин, а затем рециркуляци ей со скоростью 3 л/мин 2М раствором NaC1 в течение 15 мин, Объемное соотношение промывного реагента и носителя 2,1 л/кг сухого материала, Затем повторяют проточную промывку водой, Для увеличения срока. хранения препарата его пропитывают 0,1 М ацетатным.буфером рН 4,6. Получают

2,2 кг, 5,6 кг или 8,0 кг влажной иммобилизованной Р --галактозидаэы с активностью (Е-г сухого) и выходом (Х): 253 Е/г (65,5Х) 265 E/ã (66,0 ) или 245 Е/г (65X) соответственно, Общая продолжительность процесса иммобилизации 3,0 ч, Если проводить адсорбцию в течение 0,5 ч, то процесс продолжается 2 ч, т.е, в сутки можно изготовлять не менее 22-80 кг готовой иммобилиэованной Р -галактозидаэы.

Пример 4, В перфорированный контейнер (пример 1) помещают 560 г сухого силикагеля МСА-750 (размер частиц 0,6 " 0,6 мм). Высота слоя гранул 80 мм, Через слой пропускают со скоростью 4,0 л/мин или 220 л/мин на 1 м сечения контейнера 5Х-ный водный раствор аминопропилтриэтоксисилана в течение 30 мин. Объемный расход силана 3,6 л/кг носителя. За .ходом процесса следят по исчезновению в реагенте основного веществасилана, Концентрация силана определяется титрованием проб 0,1 M HC1, Изменение концентрации силана в рабочем реагенте в ходе силинизации силикагеля МСА-750 представлено в табл.2.

?024 4

2,0 л/мин. Проточная промывка водой осуществляется в течение 10 мин со скоростью 2,0 л/мин, а обработка

0,1 М ацетатным буфером рН 4,5 в течение 10 мин при расходе буфера

2,0 л/кг носителя. Определяемое количество активного альдегида на но сителе 0,205 мг-экв/г, Иммобилизации подвергается грибная Р --галактоэидаза с исходной активностью 56 Е/мл. Скорость рециркуляции фермента 220 л/мин 1.м сече2

10 ния при расходе реагента 3,6 л/кг носителя, Данные по иммобилизации / — галактоэидазы в слое силикагеля МСАf5

750 приведены в табл.3. ром глутарового альдегида, а также удаление нереагировавших остатков реагентов осуществляется так, как описано в примере 4, но с удельной ско2 ро стью р еаг ен то в 60 л/мин м

Для иммобилизации применяют препарат Р -галактозидазы.с исходной активностью 140 Е/мл, Скорость циркуляции при расходе ферментного ра створа 2,8 л/кг носителя 3,9 л/мин, т.е, 65 л/мин,м . Данные, иллюстрирующие ход иммобилизации /3 -галактозидаэы в слое силикагеля С-80, приведены в табл,4, Иэ данных табл,4 видно, что хотя процесс проводят в течение 6 ч, он практически заканчивается уже после

30-минутной рециркуляции ферментного раствора.

Помывка полученного препарата осуществляется по технологии, описанной в примере 4.

Расчетное количество связанного с носителем силана найдено из материального баланса по остаточной концентрации силана, После термической обработки гранул при 120 С в течение 2,0 ч прово- дят активацию носителя с помощью

1Х-ного глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН,6,85 в течение

30 мин при расходе реагента 2,2 л/кг носителя. Скорость рециркуляции реагента 105 л/мин 1 м сечения или 2

Непрореагировавший с носителем фермент удаляют проточной промывкой водой при скорости 110 л/мин на 1 м

2 сечения в течение 10 мин, затем 1 М раствором NaC1 в тех же условиях, Активность препарата 40 Е/г, т,е.

52,3 от взятой для иммобилизации активности. Получают 1,8 кг готово25 го продукта в течение 5,4 ч, т.е, 9,0 кг в сутки.

Пример 5, В перфорированный контейнер (пример 3) помещают слоем толщиной 200 мм 2,6 кг сухого сили30 кагеля С-80. Рабочая поверхность

0,06 м . Силанизация проводится

1 -ным водным раствором аминоцропилтриэтоксисиланом в течение 30 .мин при расходе реагента 4,3 л/кг носи-.

35 теля и при скорости рециркуляции

55 л/мин м, Термическая обработка при 120 С, обработка 1Х-ным раство-:

5 1317О

Получено 8,2 кг иммобилизованной

Р-галактозидазы с активностью 145 Г/г (эа 3,4 ч), что позволяет про??зводить 57,4 кг препарата в сутки, Пример 6-9, В перфорированный контейнер (пример 2) помещают

I0 Kr сухого силохрома (размерь? частиц 0,3 — 0,5 мм), Высота слоя 135мм, -рабочая поверхность гранул 0,05 м

Через слой гранул пропускают со ско- l0 г ростью 5 л/мин т,е, 100 л/мин на 1м, 1Х-ный водного раствора аминпропилтризтоксисилана в течение 0,5 ч. Термическая обработка проводится, как описано в примере 4, 15

Активация силанизированного носителя осуществляется 17-ным раствором бензохинона в зтаноле в течение

30 мин при скорости рециркуляции

120 л/мин м, Расход реагента

4,0 л/кг носителя, Промывка и подготовка для иммобилизации носителя проводится так,, как описано в примере 4, 25

Для получения иммобилизованной инвертаэы применяют препарат, полученный экстрагированием отработанных в пивоварении и измельченных пивных дрожжей, Активность в Е/мл,, т,е, 30 в мкмолях продуктов реакции гидролиза, которые образуются в течение

I мин при рН 4,6 и температуре 30 С, Данные иммобилизации в различных условиях инвертазы, полученной иэ пивных дрожжей, приведены в табл,5, Получают 3,0 кг готовой инвертазы в течение 3„9 ч, т.е, 31,2 кг в течение суток, 40

Пример 1О„Иммоб??лизацию инвертазы проводят так„как описано ?3 примере ?, но в качестве фермент??огo препарата применяют водный раствор инвертаэы марки "А" (HlI0 Виохимре45 актив") в 0.Ä1 И ацетатном буфере рН

4,6 с активностью 7200 Е/мл„Лктияность полученного фермента и?н3ертаsbI 2050 Е/r сухого, Выход акгивности

42„3X„

"0

Пример 11,, Для г?олу<?ения иммобилизовапного фермента, облад-.ющего глюкоамилазной активностью, носитель силохрома СХ"2 a?<:тивируют так, как описано в примере 7, но в качест-ве фермента применяют ра.створ гJIIOIco амилаэы "?;150" фирмы "Ново" (Дания) с активностью 2380 E-мл„ За единицы активности принято такое количеc I?30 фермента, которое в 17, — ном растворе растворимого крахмала катализирует его гидролиз при рН 4,6 -и 50 с образованием 1 мкмоль глюкозы в 1 мин °

Активность иммобилизированной

990 Е/г, с выходом 29,37., Пример 12. Для получения иммобилизованногo фермента, облаДа?с?Щего с -амилазной активностью, подготовку носителя и процесс иммобилизации проводят так, как в примере 11, но в качестве фермента применяют раствор o<, -амилазы фирмы "Ново" под фирменным названием "Bacterial

AI?ylase 120I. Перед применением ферментный препарат разводят в 10 раэ

0,1 М фосфатным буфером рН 2,6, Активность фермепта выражают в микромолях мальтозы (l) образовавшейся в течение 1 мин под действием 1 г катализатора в IX I-:.QM растворе крахма<:< ла при 50 и рН 6,2, Активность исходного фермента 2520 Е/мл, а иммобилиэованной М -амилазы 720 Е/г, (выход 37,2X), Пример 13„ В перфорированный контейнер высотой 100 мм и размером . 80 и 290 мм„ загружают 1,2 кг сухого сиг?икагел?? с-80, Высота слоя

40 мм, Технологический процесс иммобилизации -галактозидазы осуществляют, как описано в примерах 1-3, Активнбсть полученного препарата 240Е/г при выходе активности 60,8Е, количество получаемого препарата 3,8 кг, Время проведения технологических опе- раций 3 ч, Общая производительность

30,4 кг в сутки, Объемный расход каждого компонента колеблется в пределах 1,0-5,0 л/кг носителя и определяp.<ñÿ минимальным и максимальным необходимым количест-, вом осно?зного вещества H реагентах, которые мс?гут обеспе<и<вать или более нс увел??ч?3??а?от положительногo зффек?а„ 1 асхо;.-, реагепта регулируется в соoтветствии с изменением кGíöåíò" рации реа??ента и зависит от рода ре" агента, oт егo химических свойств, о? НОС;.ITÐJIß И т U,e

Ниж<3им пределом скорости рециркуляции реагентов является минимальное ко??тактное время и кратность рецирку??я??ии, ?3 тече?;ие которых намеченгый технологичес:кий процесс завершается достиясением цели, например активности иммобилизованногo фермента, Бсрхним пределом скорости является 1317024

Таблица 1

Способ по примерам

175

175

175

68, 0

52,0

43,2

25,5

42,8

27,3

10,8

13,2

8,2

9,4

5,9

6,9

8,9

4,5

60

8,4

5,2

4 1

3,0

7,6

4 3

7,2

3,8

3,0

205

155

100 максимальное контактное время и кратность рециркуляции, Удельные предельные скорости учитывают величину сечения контейнера, а также общее количество гранул в контейнере °

В качестве носителя находят применение крупнопористые, с развитной поверхностью гранулированные материалы типа силикагеля (МСА-750, С-80) или силохрома (СХ), а также другие, имеющие размеры частиц О,1 - 1,0 мм.

Высота слоя гранулированного носителя в контейнере определяется его свойствами, Главными параметрами являются гранулометрический состав, размеры гранул, пористость и другие показатели, обеспечивающие скорость самотока реагентов в пределах 25 л/мин, т,е. 40-220 л/мин на 1 м сечения слоя гранул. Увеличение высоты слоя (выше 220 мм) нецелесообразно из-за уменьшения скорости самотока, а увеличение ее можно осуществить лишь с помощью внешних сил (давление в закрытой системе, центрифугальная сила и др.), Уменьшение высоты слоя (менее 40 мм) приводит к уменьшению производительности способа и исчезновению капиллярного эффекта двиПродолжительность сорбции, мин

Высота контейнера, мм

Диаметры контейнера, м:; жения жидкости в пространстве пористого гранулированного слоя.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет увеличить активность иммобилизованных ферментов (в 8-25 раз для -галактозидазы и в 150-200 раз для.инвертазы . в расчете на 2 носителя), а также, ускорить процесс иммобилизации, 10 формула изобретения

Способ получения иммобилизованных гидролаэ 0-гликоэильных соединений, предусматривающий обработку пористого кремнезема химическими реагента- .

15 ми, водным раствором фермента и промывание носителя водными растворами . в проточном контейнере, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью увеличения ферментативной активности

20 .целевого продукта и ускорения процесса, обработку химическими реагентами и раствором фермента, а также промывание проводят в перфорированном контейнере, заполненном пористым кремнеземом с толщиной слоя 40220 мм, душированием в течение 0,1-

2,0 ч со скоростью 40-220 л/мин на

1 м при объемном расходе реагентов

1,0 - 5,0 л на 1 кг носителя, 90/150 155/260 ) 80/290

) 317024

Продолжение табл.1

Способ по примерам

Продолжительность сорбции, мин.

Сечение контейнера, м

О, 025/

/0,О68

О, 0064/ О, 018/

/0,018 /0,053

Высота слоя носителя, мм 75 125 180

Удельная скорость рециркуляции реагентов при номинальной скорости 4,0 л/мин, л/мин, м

222 75

2,4

Количество сухого С"80, кг 0,45 1,0

Количество готового продукта, кг

8,0

5,6

2,2

Ск оро с ть р ециркуля ции р еагентов при номинальной скорости 4,0 л/мин, л/мин кг

0,20

0971

1,8

253

245

255

66,0

65,0

65,0

Таблица 2

Расчетное количество свяэанного с носите"

ОстаточВремя, мин ная лем силана мг-экв Х от макс.

50,9

27,?

0,303 62,9

0,352 73,0

22,2

19,3

15 13,2

Активность, Е!г

Выход активности, Е концентрация силана, Mr ýõâ

0,404 . 83,8

0,482 100

1з

1317024

Таблица 3

Активность

Содержание белка в растворау

Е/мл растворе, мг/мл

15,5

56 0

42,8

13,0

50,0

12,5

48,6

49,2

50 0

ll 0

49,0

65,6

46,8

11,0

120

10,5

78,8

45,8

Таблица 4

Время иммобилизации, мин

Остаточная активность раствора

Е/г %

100

140

54,5

10

13,7

13,0

60

4,1

3 5

3,0

150

300

3,0

AKTHBHocTb иммобиливованного фермента после

1промывки F/r:

145

Выход, %

Время, мин

Расчетное количество свяSBHHOFO фермента, Е/r

1317024

Таблица 5

Выход, %

Объемный Способ по приме" рам инвертазы, Е/г,, сухоro

1,5

1440

70,1

1,0

73,5

1510! 5

1,0

72,0

1480

6,0(120) 1,0

1,5

73,3

1570

2,0

4, 0 (80) .1,0

Составитель В. Муронец

Техред М.Ходанич Корректор Л, Патай

Редактор И, Сегляник

Заказ 2394/23 Тираж 499

ВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д,4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул, Проектная, 4

Скорость рециркуляции фермента, л/мин (Л/мин, м ) 2,0(40)

4,0 (80) расход фермента, л/кг

Время рецирку" ляции фермента, ч

Активность иммобилизованной