Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов

Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к сахарам, в частности к твердофазному синтезу олигонуклеотидов (ОНК). Увеличение выхода ОНК, ускорение и упрощение процесса достигаются проведением его в других условиях. Твврдофазный синтез ОНК включает модификацию сегментного носителя (СН) на основе целлюлозных тканей. СН предварительно активизируют щелочной обработкой концентрированным водным аммиаком или его смесью с пиридином (Ijl по объе-. му). Модификацию проводят присоединением первого нуклеозида с помощью защищенного нуклеозид - З -0-сукцината. Последующее наращивание олигоиуклеотидной цепи защищенными нуклеотидными блоками ведут в присутствии конденсирующего агента. Испытания показывают , что диски из целлюпозных тканей промывают растворителями от реагентов в 1,5-2 раза быстрее, чем диски из бумаги. Кроме того, предварительная активация конц. NH целлюлозной ткани приводит к значительному увеличению нагрузки первого нуклеозида (в 1,8 раза для льняных и в 5 раз для хлопчатобумажных). Способ обеспечивает повышение выхода ОНК в 2,5 раза. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. (Л 00 а

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ БЛИН (50 4 С 07 Н 21/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

М ЯЛСЯ ф сом

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ г,. .",",:" ц

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

/ (54) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА

ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ (57) Изобретение относится к сахарам, в частности к твердофазному синтезу олигонуклеотидов (ОНК) . Увеличение выхода ОНК, ускорение и упрощение процесса достигаются проведением его в других условиях, Твердофазный синтез. ОНК включает модификацию сегмент(21) 3963020/23-04 (22) 09.10.85 (46) 23.06.87. Бюл. У 23 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А.И.Ломакин и С.Г.Попов (53) 547 ° 963.32.07(088.8) (56) Ломакин А.И., Попов С.Г. Автоматизированный синтез олигодезоксирибонуклеотидов. Использование сегментных носителей на основе целлюлозы.—

Биоорганическая химия, 1985, т.11, И 7, с.927-933.

„„SU„„318600 А1 ного носителя (СН) на основе целлюлозных тканей. СН предварительно активизируют щелочной обработкой концентрированным водным аммиаком или его смесью с пиридином (1:1 по объему). Модификацию проводят присоединением первого нуклеозида с помощью защищенного нуклеозид — 3 -0-сукцина( та. Последующее наращивание олигонуклеотидной цепи защищенными нуклеотидными блоками ведут в присутствии конденсирующего агента. Испытания показывают, что диски из целлюлозных тканей промывают растворителями от реагентов в 1,5-2 раза быстрее, чем диски из бумаги. Кроме того, предварительная активация конц. NH целлюлозной ткани приводит к значительному увеличению нагрузки первого нуклеозида (в 1,8 раза для льняных и в 5 раз для хлопчатобумажных) ° Способ обеспечивает повышение выхода ОНК в 2,5 раза. 1 з.п. ф-лы, 1 табл, 1 131860

Изобретение относится к биоорганической химии и биотехнологии и может быть использовано для твердофазного синтеза олигонуклеотидов как в ручном, так и в автоматизирован-5 ном варианте.

Цель изобретения — повышение выхода олигонуклеотидов, ускорение и упрощение технологии, что достигается использованием в твердофазном син- Ю тезе носителей на основе целлюлозных тканей.

Пример 1. Приготавливают образцы целлюлозных тканей: из хлопчатобумажного полотна — диски диамет- 15 ром 1 см и отрезок ленты размером

lxl см, края которых фиксируют полиэтиленом, из льняного полотна (содержащего около ЗОБ лавсана) — диски диаметром 1 см, края которых фиксиру- 20 ют полиэтиленом, и отрезок нити длиной около 3 см. Часть хлопчатобумажных и льняных дисков обрабатывают концентрированным аммиаком (используют препарат концентрации 25-28 .) в течение 3 ч,промывают водой (4х15 мл), ацетоном (3x15 мл) и высушивают на воздухе в течение ночи. К подготовленньм образцам целлюлозных тканей (общей массой около 100 мг) прибавля- 30 ют 1 08 мг (0,1 5 ммоль) 5 -0-диметокситритилтимидин-3 -О-сукцината,0,1 мл (1,35 ммоль) 1-метилимидазо ла, смесь упаривают с абс, пиридином (Зх10 мл) и прибавляют 1 мл абс. пиридина и 136 мг (0,45 ммоль) 2,4,6триизопропилбензолсульфонилхлорида.

Через 1 ч диски промывают пиридином (4 х 10 мл), прибавляют 0,2 мл

l-метилимидазола, смесь упаривают с ä> абс. пиридином (Зх10 мл), прибавляют

0,4 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида и 2 мл абс. пиридина. Через 20 мин диски промывают пиридином (4-10 мл), хлороформом (Зх10 мл)„ 4 пентаном (Зх10 мл) и высушивают на воздухе, Нагрузку первого нуклеозида определяют спектрофотометрически по количеству диметокситритилкарбинола 50 (A = 71700 в смеси хлорная кислотаэтанол 3:2).

Количество первого.нуклеозида (нагрузка) на носителе на основе целлюлозных тканей представлено в таблице.

Пример 2. Два диска (один— из бумаги "Ватман — ЗИМ", другой — из хлопчатобумажной ткани), содержащие

I в качестве первого нуклеозида 5 -00 2 диметокситритил-N б-бензоил-аденозин, помещают в реактор колоночного типа установки для автоматического синтеза олигонуклеотндов и проводят автоматизированный синтез олигодезоксирибонуклеонтида d(TCATTTTTCTATACAAATTA).

Удаление диметокситритнльной защитной группы и все промывки носителей осуществляют автоматически, раствор нуклеотидного компонента и конденсирующего реагента в абс. пиридине подают в реактор с помощью шприца, После проведения последней стадии конденсации,,промывок и удаления диметокситритильной защитной группы диски (каждый отдельно) обрабатывают 1,5 мл 0,5 И раствора п-нитробензальдоксимата лития (пиридин-вода

8:2) в течение 20 ч, растворитель упаривают на ротационном испарителе и диски обрабатывают в 10 мл концентрированного аммиака в течение 20 ч о при 45 С. Раствор отфильтровывают, диски промывают водой (2х5 мл), объединенные фильтраты упаривают до поло- . вины объема. Органические примеси экстрагируют хлороформом (2x5 ил), водную фракцию упаривают досуха. Реакционную смесь обессоливают на колонке с биогелем P-2 ° Целевой олигонуклеотид выделяют методом анионообменной ВЗЖХ в градиенте калий-фосфатного буфера. Выход олигодезоксирибо- нуклеотида d(TCATTTTTCTATACAAATTA) в расчете на первый нуклеозид составляет 0,6Х для носителя на основе бумаги "Ватман-ÇMM" (известный способ) и 1,63 для носителя на основе хлопчатобумажной ткани.

Как видно из таблицы, предварительная активация целлюлозной ткани концентрированным аммиаком приводит к значительному увеличению нагрузки первого нуклеозида (в 1,8 раза для льняных и в 5 раз для хлопчатобумажных) ° Уменьшение концентрации аммиака в 2 раза (например, использование смеси пиридин — концентрированный аммиак 1:l) дает аналогичные результаты. При этом носители на основе целлюлозных тканей в отличие от бумажных после активации и введения первого нуклеозида не разбухают и сохраняют высокую прочность (механическую стабильность) °

Пример 3. Диски из бумаги

"Ватман-3MM" или целлюлозной ткани, содержащие ковалентно присоединенный

Количество первого нуклеозида, связанного с носителем, мкмоль/г

Образец носителя

Неактивированный носитель

Акт ивиров анный концентрированньж NH

Хлопчатобумажная ткань диск

208

45 отрезок ленты

Льняная ткань

148

83 диск

65 отрезок ленты

ВНИИПИ Заказ 2479/22 Тираж 347 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 13186

5 -0-диметок ситритилтимидин, помещают в реактор установки и проводят удаление диметокситритильной защитной группы с помощью 3Х-ной трихлоруксусной KMcJIQTbl E хлорофоРме (KoHTPQJIb 5 визуальный до исчезновения окраски диметокситритилкатиона) и последующую промывку хлороформом до нейтральной реакции элюата (контроль по индикаторной бумаге через каждые 1-1,5 мин 10 промывки). Определяют время, необходимое для завершения этих операций; время полного детритилирования составляет 5-7 мин для бумажных дисков и 3-4,5 мин для дисков иэ ткани, а время полной отмывки кислоты хлороформом составляет 6-8 мин для бумажных дисков и 4-6 мин для дисков из ткани.

Таким образом, в результате сопоставления предлагаемого способа 20 твердофаэного синтеза олгонуклеотидов с известным способом подтверждается (пример 1) возможность достижения высокой нагрузки первого нуклеоI энда-на целлюлозных тканях (сравниваемой с нагрузкой на бумажных дисках в известном способе) с помощью предварительной щелочной активации и последующего присоединения первого нуклеозида. Кроме того, в многоста- 30 дийном олигонуклеотидном синтезе (пример 2) при абсолютно одинаковых реакционных условиях во всех синтетических операциях выход конечного

00 4 продукта (20-мера) на носителе из целлюлозной ткани более чем в 2,5 раза превышает выход, полученный на бумажном диске. При этом диски иэ целлюлозных тканей (пример 3) промывают растворителями от реагентов в

1,5-2 раза быстрее, чем диски из бумаги.

Формула и э о б р е т е н и я

1.Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов, включающий модификацию сегментного носителя на основе целлюлозы путем присоединения первого нуклеозида с помощью защищенного

I нуклеозид-3 -0-сукцината и последующее наращивание олигонуклеотидной цепи защищенными нуклеотидными блоками в присутствии конденсирующего реагента, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода олигонуклеотидов, ускорения и упрощения процесса, в качестве носителя используют носитель на основе целлюлозных тканей, предварительно активи« рованный щелочной обработкой.

2.Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что щелочную обработку осуществляют концентрированным водньи аммиаком или смесью пиридинконцентрированный водный аммиак (1:1 по объему).