Способ получения раствора красителя для маркирования биологической жидкости

Способ получения раствора красителя для маркирования биологической жидкости

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобрете 1ие относится к гетероциклическим соединениям, в частности к получению растнора красителя (РК) для маркирования биологической жидкости , который может найти применение в медицине. Улучшение качества РК и расширение сферы его применения достигаются использованием другого реагента и проведением процесса в других условиях. Получение РК ведут из флуоресцина и йодида щелочного металла при молярном соотношении 1:2,0- 4,5 в водно-солевом растворе в электрохимической ячейке при рН 6,0-8,0 и постоянной величине анодного потенциала . Данный способ позволяет повысить качества целевого РК, что дает возможность использовать его непосредственно для биологических исследований . В сравнении с известным полученный РК имеет лучшую оптическую плотность (на 20%) при одинаковой концентрации. Кроме того, РК позволяет получать флуоресцеиновые красители , меченные радионуклидами йода. 2 табл. i (Л 00 N5 СЛ СЛ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1325057 (д11 4 С 09 В !1/08, С 07 11 311/86, С 25 В 3/06

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, 3

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с

/ 1

- "" I ние в медицине. Улучшение качества

PK и расширение сферы его применения (21) 3885066/23-04 (22) 18.04.85 (46) 23.07.87, Бюл. У 27 (71) Филиал по разработке готовых лекарственных средств Научно-исследовательского института по биологическим испытаниям химических соединений и Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (72) В.Н.Кулаков, Г.H.Пименова и М.С.Долгих (53) 547.633.6.07 (088.8) (54) СПОСОБ 11ОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА КРАСИТЕЛЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

ЖИДКО СТИ (57) Изобретение относится к гетероциклическим соединениям, в частности к получению раствора красителя (PK) для маркирования биологической жидкости, который может найти применедостигаются использованием другого реагента и проведением процесса в других условиях, Получение РК ведут из флуоресцина и йодида щелочного металла при молярном соотношении I: 2,04,5 в водно-солевом растворе в электрохимической ячейке при рН 6,0-8,0 и постоянной величине анодного потенциала. Данный способ позволяет повысить качества целевого РК, что дает возможность использовать его непосредственно для биологических исследований. В сравнении с известным полученный PK имеет лучшую оптическую плотность (на 20K) при одинаковой концентрации, Кроме того, PK позволяет получать флуоресцеиновые красители, меченные радионуклидами йода.

2 табл, 1325057

Изобретение относится к способу получения раствора красителя для маркирования биологической жидкости, который может найти применение в медицине, Цель изобретения — улучшение качества целевого продукта и расширение сферы его применения °

Укаэанная цель достигается за счет взаимодействия флуоресцина с йодидом щелочного металла при соот10 ветствующих значениях реагентов, величинах рН и постоянном значении анодного потенциала, 15

Пример 1, F, электролнзер с платиновыми электродами вносят 10 З M флуоресцина в 5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,0, содержащего 0,9 хлористого натрия и 4 5» 20

»10 Г1 йодида калия (молярное соотношение йодид калия: флуоресцин

4,5:1). Процесс электролиза проводят при величине анодного потенциала

0,5 В в течение 1 ч, Выход красителя 25 йодированного флуоресцеина 977., Выход целевого продукта определяют спектрофотометричеcKH IIQ снижению экстинкции длинноволновой полосы исходного красителя ипи методом радио- 30 активных индикаторов с использованием радионуклидов 131„ пли 125,.

Пример 2. Йодирование флуоресцина проводят аналогично примеру

1, но в качеств» йодсодержащего реагепта используют 40 МБк натрий йодистого (йод — 125). Для определения выхода красителя по окончании электролиза пробу реакционной смеси наносят на полоску ацетатцеллюлозной 40 пленки, Пленку помещают в ванну электрофоретического прибора и проводят электрофорез в течение 15 мин в 0,2 М боратном буфере с рН 8,0 при 350 В.

Идентификацию радиоактивных веществ 45 на электрофореграмме осуществляют методом авторадиографии. Лктивность полос определяют на гамма-счетчике, Гезультаты опытов приведены в табл.1.

Пример ы 3-5. Процесс осуще ствляют аналогично примеру 1 при других соотношениях реагентов.

Пример 6. В электролиэер помещают 1О MI аминофлуоресцина (2,9 »

»1О М) в 8 мл 0,2 М трис-HCI буферного раствора с рН 7,6 и 0,1 М йодида натрия (молярное соотношение йодид натрия: аминофлуоресцин 2,0:1 ).

Электролиз проводят 50 мин при величине потенциала платинового анода

0,53 В. Выход 997.

Пример ы 7, 8, Процесс осуществляют аналогично примеру 6 при других соотношениях реагентов, Выбор диапазона рН 6,0-8,0 связан с необходимостью достижения диссоциации фенольного гидроксила молекулы флуоресцина, При значении рН меньше указанного диапазона снижается скорость реакции, а увеличение рН (больше 8,0) небезопасно для биологических объектов, Кроме того, при рН, большем, чем 10,0, возможно протекание побочных процессов. В качестве водно-солевых растворов для проведения процесса могут быть использованы неорганические буферные растворы, имеющие рН в указанном диапазоне.

Оптимальным является применение фосфатных буферных растворов с величинойpfl 7,0-7,6.

В предлагаемом способе испольэуется молярное соотношение йодид щелочного металла: флуоресцин, равное 2,04,5:1,0. При соотношении меньшем, чем 2,0:1,0, часть исходноro флуоресцина остается непрореагировавшей, что приводит к снижению выхода целевого продукта, а увеличение соотношения (больше 4 5:1,0) нецелесообразно, вследствие невозможйости введения в молекулу флуоресцина более 4,0 атомов иода.

В качестве йодидов щелочного металла предпочтительнее йодиды натрия и калия, так как ионы натрия и калия не изменяют свойств биологических объектов, В укаэанных солях йодид-ион может быть радиоактивным. Получение радиоактивного целевого продукта расширяет сферу его применения в биологических исследованиях.

Биологические испытания красителей.

Полученные растворы красителей могут быть использованы непосредственно (беэ дополнительной очистки и выделения) в биологических исследованиях.

Раствор радиоактивного красителя, полученный предлагаемым способом с применением в качестве йодсодержащего реагента йодистого натрия, меченного 125,, используют в биологических исследованиях ° Исследования про1 32 5057

45

50 водят на белых бе спородных крысах.

1 астнор красителя вводят в хвостовую вену, Чере з определенные промежутки времени определяют содержание краси5 теля н крови, моче и почках. Необходимость использонания радиоактивного раствора красителя н данном случае вызвана невозможностью точного количественного определения красителя í 10 таких биологических объектах, как моча, почка, печень, желчь оптическими методами.

Крысам н хвостовую вену вводят

0,1 мл раствора красителя, полученного по примеру 2, концентрацией

1 мг/мл, удельная радиоактивность

38 МБк/мл. Через 5, 15, 30, 60, 180 мин животных (по 3 шт.) забивают декапитацией и определяют содержание 20 радиоактивности н интересующих органах и тканях (кровь, печень, почки, моча). Радиоактивность определяют методом прямой радиометрии. Содержание красителя (7 от введенной внутри- 25 ненно дозы) в крови, мочи, печени и почках крыс н разные сроки после инъекции (краситель получают по примеру 2) приведено н табл.2.

Манные табл.2 свидетельствуют î 30 ноэможности использования раствора красителя беэ его дополнительной очистки для изучения процесса проницаемости почечных мембран.

Для цитологических исследований, 35 оснонанных на оптических методах определения красителя, можно применять нерадиоактивный раствор красителя, В условиях предлагаемого способа получают окрашенные йодпроизводными флуоресцеиноными красителями полисахариды различной молекулярной массы.

По данным гельфильграции на ультрагелях в процессе их получения не отмечают изменения молекулярной массы полисахаридон. Максимумы поглощения исходного и полученного окрашенных полисахаридов отличаются на 9-33 нм (490 нм — оранжевый, 510-525 нм красный), н зависимости от степени йодиронания.

В присутствии радионуклида йод—

125 лолучаюг радиоактивные полисахариды, окрашенные флуорег гц и но ными красителями, которые используют для изучения их фармакокинетил.и н дозах

0,5-,0 мг/кг веса животных. 11зучение фармакокинетики полисахаридов, вводимых в указанных дозах иными способами, кроме использования меченных радионуклидами образцон, практически невозможно, При введении раствора красителя эритрозина В, полученного по известному способу той же концентрации в хвостовую вену крысам около 507, животных погибают в течение получаса, следовательно, непосредственно использование этих растворов (беэ дополнительной очистки) для биологических исследований невозможно.

Таким образом, использование предлагаемого способа получения растнорон красителей обеспечивает улучшение качества целевого продукта, которое выражается в возможности непосредственного использования растворов красителя для биологических исследонаний, а также н большей (на

207) оптической плотности растворов красителей, по сравнению с известным способом при одинаковой концентрации, расширение сферы применения красителей в биологических исследованиях, которое выражается в возможности получения флуоресцеиновых красителей, меченных радионуклидами йода ° формул а и з о б р е т е н и я

Способ получения раствора красителя для маркирования биологической жидкости путем взаимодействия фпуоресцина с йодсодержашим реагентом в водно-соленом растворе в электрохимической ячейке, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта и расширения сферы его применения, в качестве йодсодержащего реагента используют йодид щелочного металла лри молярном соотношении флуоресцина и йодида щелочного металла 1:2,04,5 соответственно и взаимодействие осуществляют при р11 6,0-8,0 и постоянной величине анодного потенциала.

1325057

1 х!

Э

IIj с»

1 !

o o

С4 С4

О О

N N С 4

СЧ О) ОО

С4

° ) »

Z о о х

Х 1» ° и э са м

Z ац

1 о х л сп л

00 О) О) I х

В»Р

С

)х х

Х и

Э

Р х а

1 о а

1»

Х о л о o - со а о

Ch ) )) Ch О ) О ) О) Ch Ch

o o

)С) Л

° ) o o

О

4:) о

Х III

Э р

СС!

o, o

»

) О

Ю л в

ICI O и

)2 )х )я )х .О 2 .О 7 х х х х

1 F I» 1

CIj С)! Ilj С)1 е в е

v и и и

С! !

„"а э о

СС!

Е» х о

1 о

3 3 8 3

K K Е Х и х

Cj, о

E и ф

С4

Ю

1

Сф а

Ц х

Ц р

1 х

Э с» ()1

Э а а o o o o o o

О Ф Ю Ю Ю

Ф N W С ) СЧ С 4 С 4

)4 !

Э

E х и

Ijj а

)х ,)! х

C( о х и х

N С») t Ю )C) Л CC) 1 х

Е ! о х х

Й .о х

1 о о

v о х

А ! о

X х

f»

v о х

Е» о !

)х о х и

Ц о

Ю

tg

Э

Е х и

С!! а

Щ !

»

Cj

Э

CI !

» о

1-" о о! х ц ! !» Э о о х м х и

Е» ф

-о а ! rQ

Ю 1о о

o хо

v. ох и х1- о ииа

Э Э 1 р mme.

E Х с)) х х .г

Э а I о ъ

Ц е

О си О С) )Л

-т л о а

Ю Ф Ю

О О О O O

О О с) Ф O

Ю Ю Ю е

СО 4:) Л Л СО

)Q —

u u 1- Х х х

1 &

u v u ð х х и а а 8 >

Е

K Х K л 1 сч сч о <ч

Ю Ф Ю

o o o o х х

1 и

Э а о

>)

3 о х х

1 325057

Таблица2

Объект Содержание красителя, 7 от введенной внутривенно дозы через мпн

15 30 60

5 (180

42,2 21,0 34,8 15 6 5 3

40 7 23 1 34 8 23 1 5 3

41,0 21,7 29,9 18,6 5,6

23,7 15,7 17,8 7,6 . 7,6

21 5 15 9 20 6 14 2 4 9

26,6 14,1 )6,4 11,6 7,2

7 5 5 0 6 6 4 5 8 4

7,2 5,7 6,6 4,4 3,0

7,7 4,8 5,7 5,0 4,4

Кровь

Печень

Почки

Моча

7,8 10,7 22,6 22,4

3 8 8 8 25 3 40 0

3 6 88 17,1 28 9

Со ста витель И, Дьяченко

Редактор ((,1 унько Техред И.Попович Корректор Е,Рошко

Заказ 3019/2 Тираж 633 Подписное

1((((!()П(1 ) осударстве нного комитета СССР ио делам изобретений и открытий

11 !О !, Москва, Ж-35, Раущская наб,, д. 4/5

Произвощствени - полиграфическое предприятие, г ° Ужгород, ул. Проектная, 4