Способ получения иммобилизованной рибозофосфатизомеразы
Иллюстрации
Показать всеРеферат
Изобретение относится к технологии получения иммобилизованных ферментных препаратов. Оно может быть использовано в производстве химических реактивов, для биотехнологических целей при создании модельных систем, фиксирующих углекислоту. Цель изобретения - увеличение стабильности и удельной активности иммобилизованной рибозофосфатизомеразы, а также ускорение процесса. Сущность способа заключается в том, что проводят иммобилизацию данного фермента на аминоэтил-целлюлозе, которую предварительно активируют глутаровым альдегидом, причем связывание фермента осуществляют в 0,008-0,012 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин. Способ позволяет получить фермент с повьшенной (в 2 раза) удельной активностью и стабильностью. (Л СлЭ to 05 05
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСГ1УБЛИН
„,SU,„,1326616
А1 (51)4 С 12 N 11/00, 9/90
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3898255/28-13 (22) 28.03.85 (46) 30.07.87. Бюл. У 28 (71) Институт физиологии и биофизики растений АН ТаджССР (72) В.В. Иванищев, И.К. Хасанов и Ю.С. Насыров (53) 577.15 (088.8) (56) Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В. Березина и др. М.: МГУ, 1976, т. 2, с. 312.
Snekane М. Z. allg. Microbiol.
1982,,v 22, У 8, р. 565-576 ° (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОИ РИБОЗОФОСФАТИЗОМЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к технологии получения иммобилиэованных ферментных препаратов. Оно может быть использовано в производстве химических реактивов, для биотехнологических целей при создании модельных систем, фиксирующих углекислоту. Цель изобретения — увеличение стабильности и удельной активности иммобилизованной рибозофосфатиэомераэы, а также ускорение процесса. Сущность способа заключается в том, что проводят иммобилизацию данного фермента на аминоэтил-целлюлозе, которую предварительно активируют глутаровым альдегидом, причем связывание фермента осуществляют в 0,008-0,012 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0-7,2 в течение
50-60 мин. Способ позволяет получить . g фермент с повышенной (в 2 раза) удельной активностью и стабильностью.
1
13
Изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в производстве химических реактивов и для биотехнологических исследований.
Цель изобретения — увеличение стабильности и удельной активности иммобилиэрванной рибозофосфатиэомераэы, а также ускорение процесса.
Изобретение заключается в том, что при иммобилизации фермента на аминоэтил-целлюлозе (AE-целлюлоза) используют в качестве поперечно-сши-! вающего реагента глутаровый альдегид, оторый добавляют не к ферменту, а к носителю. Подбор условий иммобилизации (глутарового альдегида, натрийфосфатного буфера в концентрации
0,008-0,012 М с рН 7,0-7,2, времени инкубации 50-60 мин) позволяет по сравнению с известным способом в два раза увеличить удельную активность иммобилиэованного фермента, в 9 раз повысить стабильность препарата и в 4 раза ускорить процесс иммобилизации.
Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.
Пример 1. К 1 г АЕ-целлюлозы приливают 50 мл 0,5 í. NaOH перемешивают и через 5 мин сливают. Затем
AE-целлюлозу отмывают дистиллированной водой 8-10 раз по 50-100 мл до рН 7-8. Далее к AE-целлюлозе приливают 50 мл 0,5 í, НС1 перемешивают и через 2 мин сливают. АЕ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой до рН 4-5 (6-8 раз по 50-100 мл). После этого к АЕ-целлюлозе приливают
50 мл 0,5 í, NaOH перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20 С) . Затем отмывают AE-целлюлозу дистиллированной водой до нейтральной рН (10 раз по 100 мл), Далее к АЕ-целлюлозе приливают 50 мл
0,5 M натрий-фосфатного буфера с рН
7,0. Через 10 мин раствор сливают.
Активирование AE-целлюлозы проводят следующим образом.
К АЕ-целлюлозе приливают 10 мл
2,57-ного раствора глутаральдегида в
О;5 М натрий-фосфатном буфере с рН
7,0 (к 1 мл 25Х-ногб водного раствора глутаральдегида добавляют 9 мл, 0,5 М натрий-фосфатного буфера с рН
7,0) и выдерживают в течение 1 ч при комнатной .температуре при слабом периодическом встряхивании. После чего
26616 носитель промывают 10 pas дистиллированной водой (по 100 мл) для удаления избытка глутаральдегида. Отмытую
5 дистиллированной водой АЕ-целлюлозу эабуферивают 0,01 M натрий-фосфатным буфером с рН 7,0 добавлением 50 мл буфера. Буфер сливают и AE-целлюлозу еще дважды промывают новыми порциями
1ð того же буфера.
К активированной таким образом
АЕ-целлюлозе приливают 3-5 мл ферментного препарата рибозофосфатизомеразы (концентрация белка 4-10 мг/мл).
Эту смесь инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, периодически слабо перемешивая или встряхивая. Затем раствор сливают и иммобилизованную рибозофосфатизомеразу отмывают 2-3 раза по 50 0,01 M натрий-фосфатным буфером с рН 7,0. При этом конечный буфер (которым промывают препарат)- не содержит белка, что с определяют по поглощению раствора
25 при 280 нм.
Затем иммобилизованную рибозофосфатизомераэу отмывают 2 раза по 50 мл
0,5 M раствором NaC1 в 0,01 М натрийфосфатном буфере с рН 7,0. Такая проЗр цедура позволяет определить количество фермента, ковалентно связанного с носителем. Этот способ позволяет связывать до 7-8 мг фермента на 1 г активированной АЕ-целлюлозы. При этом удельная активность иммобилизованной
35 рибоэофосфатизомеразы составляет 50607 от удельной активности исходного ферментного препарата рибозофосфат- иэомеразы. Удельная активность препа4р рата составляет 16 ед./1 мг белка.
Пример 2. Способ осуществляли как описано в примере 1, но рН буфера для иммобилизации составлял
6,5; 6,8; 7,2; 7,5. Удельная актив4 ность иммобилиэованного фермента при этих значениях рН была, равна соответственно 6, 12, 15 и 8 ед./мг белка.
Следовательно, оптимальная величина рН буфера равна 7,0-7,2.
Пример 3. Способ осуществля-ли как описано в примере 1, варьируя концентрацию буфера — 0,015; 0,012
0,008; 0,005 и 0,001 M. Удельная активность фермента в этих условиях составляла соответственно 10, 13, 14, 8 и 6 ед./мг белка, оптимальная концентрация буфера 0,08-0,012 M.
Пример 4. Способ осуществляли как описано в примере 1, варьируя
Составитель В. Муронец
Редактор Н, Киштулинец Техред А.Кравчук
Корректор В,Бутяга
Заказ 3248/21 Тираж 499
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Подписное
Производственно-полиграфичеакое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4
3 13266 время иммобилизации 45-70 мин. При времени инкубации 50 и 55 мин активность фермента составляет 15 ед/мг белка а при 45 и 60 и выше — 13 и
Э
16 ед./мг белка. Оптимальное время: инкубации 50-60 мин, так как увеличение длительности инкубации нецелесообразно, поскольку оно не приводит к повышению активности фермента.
Стабильность полученного препарата при хранении, определенная как время, в течение которого теряется
507 активности, составляет 60 дней (Pi = 60 дней). Время, необходимое для проведения иммобилизации 7 ч °
Таким образом, по сравнению с известным способом предлагаемый позволяет увеличить стабильность и удельную активность иммобилизованного фер- 20 мента соответственно в 9 и 2 раза, а также в 4 раза ускорить процесс иммобилизаций.
Предлагаемый способ позволяет получить-иммобилизованный ферментный
16 о препарат рибозофосфатизомеразы, пригодный для использования его npu создании модельных систем фиксации углекислоты, что имеет важное практическое значение.
Формула изобретения
Способ получения иммобилизованной рибозофосфатиэомеразы, заключающийся в иммобилизации фермента на аминоэтил-целлюлозе с помощью поперечно-. сшивающего реагента в буферном растворе и последующем отмывании несвязанного белка, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения . стабильности и удельной активности целевого продукта, а также ускорения процесса, в качестве поперечно-сшивающего реагента используют глутаровый
1 альдегид, который добавляют к аминозтил-целлюлозе до внесения фермента, а иммобилизацию проводят в 0,0080,012 М натрий-фосфатном буфере при . рН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин.