Способ получения коллагеновых пептидов,содержащих участок связывания с фибронектином
Иллюстрации
Показать всеРеферат
Изобрет ние касается пептидов, в частности пс лучения коллагеновых пептидов, со;;ер ая1их участок связывания с фиб1кпи кти 1ом, которые используют в биохимии. Цель - упрощение процесса и повьпиение выходацелевых продуктов. ПолучеЙие ведут бромцианфрагментированием коллагена с последующим хроматографированием в определенных условиях, Хроматографирование ведут на сефарозе с иммоболизированным желатин-связывающим доменом фибронектином, уравновешенном 0,04- 0,06 М трис-НС1-буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,1-0,15 М. хлористого натрия при скорости тока 150-250 мл/ч и 37-40 С. Затем полонку промывают 1-1,5 М мочевиной в урапновешивафщем буферном раст норе, а элюирование коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином , проводят 4-8 М растворами мочевины в указанном выше буферном растворе. Способ позволяет сократить число стадий с 5 до 2, время процесса в три раза и повысить выход с 5 до 25%. СО ts9 СП
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН
„„SU 132 511
А1 (5!)4 С 07 К !5/06
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
М
baal
СЛ
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 07.06. 88. Бюл. N - 21 (2!) 3927840/31-04 (22) !2.07.85 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР (72) Б.А.Клящицкий, В.Х.Митина, Н.А.Французова, А.E,Áåðìàí, В.В.Бычкова и В.И.Мазуров (53) 547.964.4.07(088.8) (56) М.Click, P.Bornstein "Isolation
and characterization of the cyanogen
bromide peptides from 11 and 3 2 chains of human skin collagen". Piochemistry !970, 9, 24, 4699-4706. (54) Сl!ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХ
ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖА!!!ИХ УЧАСТОК СВЯЗЫВАНИЯ С ФИБРОНЕКТН!!ОМ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получе»»ня коллагеновых пептидов, содержал»их участок связывания с ф»»бро»»..ктн.»ом, которые используют в биоми»»»»;», Цель — упрощение процесса и повышение выхода- целевых продуктов. Получейие ведут бромцианфрагментированием коллагена с последующим хроматографированием в определенных условиях. Хроматографирование ведут на сефарозе с иммоболизированным желатин-связывающим доменом фибронектином, уравновешенном 0,040,06 М трис-НС1-буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,1-0,15 М, хлористого натрия при скорости тока
150-25О мл/ч и 37-40 С. Затем полонку промывают 1-1,5 М мочевиной в уравновешива»0шем буферном растворе, I а элюирование коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектнном, проводят 4-8 М раствора- Е ми мочевины в указанном выше буферном растворе. Способ позволяет сократить число стадий с 5 до 2, время процесса в три раза и повь»сить выход с 5 до 257..! 13275
Изобретение относится к усовершен ствованному способу получения коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, биологически активных соединений, которые находят применение в биохимии.
Цель изобретения - упрощение процесса коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронекти" !О ном, повышение выхода целевого продукта.
Пример 1. Получение d l-СВ 7 бромцианоного пептида коллагена.
А. Бромциан — фрагментация целой молекулы коллагена. Раствор 180 мг коллагена из кожи крыс в 18 мл
70 -ной муравьиной кислоты насыщают
И.„, добавляют 200 мг бромистого циана и полученную смесь инкубируют 5 ч при 25 С. Реакционную смесь обессоо
20 ливают на колонке с биогелем P-2 (Ч 100 мл), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой, Скорость тока
45 мл/ч. Фракцию, ныходящую с исключающим объемом колонки,.лиофилиэуют и получают 165 мг смеси бромцианоных пептидов коллагена, Б. Выделение d 1-СВ7 пептида из смеси бромцианоных пептидов коллагена. Полученную смесь бромцианоных
ЗО пептидов коллагена (!65 мг) растворяют в 20 мл 0,05 М трис-НС1 рН 7,4., с 0,15 M хлористым натрием при нагревании до 40 С и раствор перемешивают при 20 С в течение 1 ч с 15 мл сефарозы 4В, содержащей иммобилизонаниый желатинснязынающий домен фибронектина (мол.в. 45000) (содержание домена в адсорбенте 1-2 мг/мл упакованного объейа геля). Затем адсорбент упаковывают в колонку, промывают уравновешивающим буферным раствором (50 мл), затем тем же раствором, содержащим 1 M моченину (50 мл). Скорость тока 200 мл/ч. d 1-СВ7 пептид 45 элюируют уравновешивающим буферным раствором, содержащим 4 М моченину.
Фракцию, содержащую 1-СВ7 пептид, обессолинают на колонке с биогелем
Р-2, уравновешенным 0,1 М уксусной 50 кислотой, и лиофилизуют. Выход d !-СВ7 пептида 7,5 мг -.(25X). Продукт был электрофоретически гомогенным при электрофорезе в полиакриламидном ге" ле в присутствии додецилсульфата нат- 55 рия (мол. в. около 25000).
При скорости потока 150 мл/ч, температуре 37 С получают d l"ÑÂ7 пептид с вьгходом 27 ., ll 2
11 р и м е р 2. Получение насцентных коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибропектином.
Раствор смеси насцентных Р„-пепти" дов, полученных в бесклеточной системе биосинтеза белка и меченных Нпролином (суммарная радиоактивность
1,5 ° 10 распадов/мин), в 3 мл 0,05 М трис-НС1, рН 7,6, с 0,15 М хлористым натрием инкубируют в течение 1 ч при
20 С с 3 мл иммобилиэоваиного на сефарозе 4В желатинсвяэывающего доме- . на фибронектина. Адсорбент упаковыва" ют н колонку, промывают 40 мл уравновешивающего буферного раствора до от" сутствия радиоактивности в элюатах.
Скорость тока 200 мл/ч. Затем колонку.промывают 1 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе (15 мл) и насцентные пептиды коллагена, содержащие участок связывания с фибро" нектином, элюнруют 8 И мочевиной в уравновешивающем буферном растворе.
Суммарная радиоактивность полученной фракции (6 мл) - 5 10 распадов/мин.
После диализа этой. фракции против
0,05 M трис-НС1 буферного раствора, рН 7,6, содержащего 1 М хлористый натрий, проводят анализ целевых насцентных пептидов коллагеназной реакцией.
Аналогичные результаты получены при проведении хроматографии смеси насцентных пептидов при 40 С и скорасти тока 250 мл/ч.
К 0 1 мл исходных и полученных после хроматографии насцентных Р— . пептидов, меченных !Н-пролином (l !О распадон/мин), добавляют 10 мкл
3 раствора коллагеназы (1-5 мкг белка), свободной от примеси других протеинаэ. Контрольные пробы не содержат коллагеназу. 11робы инкубируют н течение 90 мин при 37 С, после чего пептиды осаждают равным объемом ,l0X-ной трихлоруксусной кислоты с
0,5Х таннина. Осадки собирают на фильтры (Millipor), высушивают и определяют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Расщепление Рпептидов рассчитывают по формуле
0п 100
Р =!00 --- —— е
К где 0„ - радиоактивность опытных проб;
К вЂ” радиоактивность контрольных проб.
27511 4
1О
3 l3
Согласно полученным данным исходная смесь насцентпых P -пептидов расщеплялась коллагенаэой на !57, в то время как насцентные пептиды, элюированиые с аффинного адсорбента 8 M. мочевиной в уранновешивающем буферном растворе, расщеплялись Hà 90Х.
Таким образом, элюированный с колонки препарат на 90Х состоит из насцентных коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, Пример 3. А, Получение желатинсвяэывающего домена фибронектина.
300 мг лиофилиэованного фибронектина иэ плазмы крови человека суспендируют в 60 мл 0,025 М трис-НСI буферного раствора, содержащего 0,5 ммоль
ЭДТА и 50 ммоль NaC1 (рН 7,0), добавляют I мг Ы-химотрипсина и смесь инкубируют при перемешивании 1 ч при
37 C. Затем к смеси добавляют 3 мг ингибитора трипсина из соевых бобов и ммоль фенилметилсульфонилфторида, через )О мин центрифугируют при
10000 об/мин н течение 10 мин, супернатант наносят на колонку (V 60 мп) с желатин (сефарозой) уравновешенную
0,025 М трис-НСI буферным раствором с 0,5 ммоль ЭДТА и 50 ммоль NaC1 (рН 7,0), колонку промывают тем же буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм н элюатах и желатинсвязывающий домен фибронектина элюиронали, добавляя в буферный раствор 4 М мочевину. Соответствующие фракции (60 мл) диализуют против
2 л 0,1 M уксусной кислоты. Выход желатинснязывающего домена после лиофилизации — 25 мг, мол. масса около 45000. При электрофорезе в
l2,5i.-полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфоната натрия продукт был гомогенен.
Б. Получение адсорбента "домен фибронектина (мол. масса 45000) сефароза 4В".
Лиофипизованиый желатинсвязывающий домен фибронектина, полученный в и. А (25 мг),растворяют в 15 мл
0,l М бикарбонатного буферного раствора, рН 8,4, содержащего 0,15 М
NaC1 и перемешивают с 15 мл BrCN— активиронанной сефарозы 4В (активирована по стандартной методике с использованием 2 r BrCN íà 10 мл упакованного объема сефарозы) в течео иие 16 ч при 4 С. Сорбент промынают
50 мл того же буферного раствора, 50 мл воды и перемешивают 2 ч прн
20Я(: с 15 мл М раствора этаноламина (рН 9 с помощью 6 н, НС1), Сдрбент отделяют и триждь промывают по 50 мл
0,1 М натрийацетатного буферного раствора с М NaC1 рН 4,5 и .О,l М натрийборатного буферного раствора с
1 М ИаС1, рН 9. После промывания водой сорбент хранят в виде суспензии в воде в присутствии 0,02Х азида натрия. Количество присоединенного домена определяют дифференциальным методом по разности поглощения при
280 им исходного раствора лиганда и промывных вод после присоединения.
Сорбент содержал 1,5 мг домена на
1 мл упакованного объема геля.
Такие параметры хроматографического процесса, как геометрия колон ки или условия последующего обессоливания соответствующих фракций не сказываются на конечных результатах.
Обессолинание фракций проводят на колонках с биогелем Р-2, уравновешенных 0,1 М уксусной кислотой, при скорости тока 30-50 мл/ч и объемном соотношении вводимого образца к общему объему колонки !:5. Те же результаты
30 получены и при использовании для обессолинания сефадекса С-25. Что касается скорости тока при афинной .хроматографии, то хроматографию денатуриронанного коллагена и коллагеноных
35 пептидов обычно проводят при температуре до 40 С и при большой скорости тока из-за склонности этих биополимерон к ренатурации и гелеобразованию.
Поэтому скорость тока в описываемом процессе целесообразно поддерживать в интервале 150-250 мл/ч. Выбор уравновешивающего буферного раствора (0,05 М трис-HCI, рН 7, 4-7,6 с О,I0,15 НаС1) обусловлен необходимостью создания на колонке оптимальных условий для взаимодействия иммобилизонанного домена с пептидами, содержащими участок связывания с фибронектином.
При использовании 0,04-0,06 М буферов результаты выделения оказываются практически идентичными, как и в случае использования 0,1-0,15 М концентраций NaC1. Применение концентраций
NaC1 менее 0,1 М приводит к менее чистым пептидам, содержащим участок связывания с фибронектином, а более
0,15 М - к элюиронанию части этих пептидов при промывании колонки уравновешивающим буферным раствором и
Составитель В.Волкова
Редактор -Т.Герасимова Техред И.Верес Корректор А,Тяско
Тираж 348 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета. СССР ло делам изобретений и открытий
1!3035, Москва, )K-35, Раушская наб,, д, 4/5
Заказ 3392
Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. !!р»-.к.глав,4
5 13275 ! И мочевиной в том же буфере, что уменьшает выход целевого продукта.
Стадия промывания колонки 1 М мочевиной предназначена для удаления с колонки неспицифически адсорбиро5 ванных пептидон, не содержащих участка связывания с фибронектином, Для этой цели использованы растворы мочевины в концентрации.1-1,5 М. При . концентрации моченины меньше 1 M неспецифические пептиды удаляются не полностью, загрязняя целевбй продукт, при концентрации,большей, чем 1,5 И происходит частичное элюирование коллагеиовых пептидоЬ, содержащих участок связывания с фибронектином, что снижает выход целевых продуктов.
То же относится и к условиям элюции, поскольку согласно биохимическим данным 4-8 N мочевина эффективно разобщает биоспецифическое взаимодействие фибронектина и коллагена (желатина)
При использовании концентрации мочевины меньшей, чем н описываемом про" цессе, возможно вымывание пептидов неспецифически связанных с сорбентом за счет электростатических или гидрое фобных взаимодействий.
Пример 4. Раствор бромцианоных пептидов Ы 1-цепи коллагена (100мг1 в 12 мл 0,06 М трис-НСI, рН 7,5 с
0 1 М хлористым натрием перемешивают при 20 0 в течение 1 ч с 10 мл сефарозы CL-4B, содержащей иммобилизован. йый желатин-связывающий домен фибронектина (1 мг/мл упакованного объе" ма), сорбент упаковывают н колонку, промывают уравновешивающим буферным раствором (50 мл), затем тем же раствором, содержащим 1,5 M мочевину (30 мл). Скорость тока 150 мл/ч.Целе40 вой Й 1-СВ7. пептид элюируют уравнове11 6 шивающим буферным раствором, содержащим 6М моченину. Соответстнункцую фракцию обессоливают на колонке с биогелем Р-2 уравновешенным 0,1 М уксус" ной кислотой, лиофилизируют. Выход а!"СВ7 пептида 4,4 мг (24,5X)i Ilpoдукт идентичен Ы 1-СВ7 пелтиду, полученному в примере 1.
Описываемый способ получения нас- . центных пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, позволяет сократить число стадий с 5 до
2 время проведения процесса сокра- щается в три раза, ныход увеличивается в пять раз (с 5Х до 25X).
Формула изобретения
Способ. получения коллагеноных пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, включающий броманфрагментирование коллагенна и последующую хроматографию смеси бромциановых пептидов с. использованием в качестве элюента буферных растворов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода, хроматографию проводят на сефарозе с иммобилизованным желатинсвязывающим доменом фибронектина, уравновешенном 0,04-0,06 М трис-НС! буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,10-0,15 М хлористого натрия при скорости тока 150-250 мл/ч, температуре 37-40 C с последующим промыванием колонки 1-1,5 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе, элюиронание коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, проводят 4-8 М растворами мочевины н том же буферном растворе.