Способ определения 17-кетостероидов в моче

Способ определения 17-кетостероидов в моче

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биологии и медицине, точнее к способам исследования андрогенов, предназначено для вьшвления вариантов превращения 17-кетостероидов (17-КС) в организме , а также для диагностики эндокринной патологии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Для этого пробы из суточндго количества мочи с рН 6,5 охлаждают, добавляют ацетатный буфер (рН 4,5) и навеску И-глюкуронидазы 30000 ед. активности , вьщерживают .в термостате при 37°С, через сутки добавляйТ ту же дозу фермента и держат еще сутки. После гидролиза приливают 40%-ный раствор формальдегида, кипятят 2мин, охлалвдают, отделяют выпавший в осадок денатурированный фермент центрифугированием . Надосадок сливают, экстрагируют двумя объемами смеси хлороформ - диэтиловый эфир (1:1). Образовавшуюся эмульсию расслаивают, как и весь экстракт, и объединяют с органической и водной фазами. Экстракт промьшают насьлценным раствором бикарбоната натрия и дистиллированной водой, сушат и выпаривают при 40 С. После отгонки диэтилового эфира выпаривают хлороформ, освобождают от большинства липидов. В пробе мочи хроматографированием выделяют глюкурониды и сульфаты 17-кетостероидов, окрашивают их 2,4-динитрофенилгидразином, раздельно хроматографируют. Затем фотоэлектроколориметрируют в микрокюветах с короткофокусными линзами . Расчет фракций проводят по концентрационной кривой, построенной после хроматографирования различных количеств дегидроэпиандростерона с учетом суточного диуреза. Способ позволяет раздельно анализировать 17-КС, находящиеся в соединений с глюкуроновой и серной кислотами, В результате исследуют До 24 индивидуальных 17-КС, что имеет важное значение в оценке андрогенной функции коры надпочечников и половых желез (Л ел 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (59 4 С 01 N 33/74

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 3950369/28-14 (22) 25.07.85 (46) 07.08.87. Бюл. У 29 (71) Семипалатинский государственный медицинский институт (72) М. Е. Зверев, В. Г. Шелихов и С. В. Жданов (53} 616.07(088,8) (56) Комиссаренко В. П., Демченко В. Н. Количественное определение

8 важнейших фракций 17-кетостероидов с помощью двумерной тонкослойной хроматографии в моче человека. — Лабораторное дело, 1974, У 2, с. 73-76. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 17-КЕТОСТЕРОИДОВ В МОЧЕ (57) Изобретение относится к биологии и медицине, точнее к способам исследования андрогенов, предназначено для выявления вариантов превращения

17-кетостероидов (17-КС) в организме, а также для диагностики эндокрин-, ной патологии. Цель изобретения

l повышение чувствительности способа.

Для этого пробы из суточндго количества мочи с рН 6,5 охлаждают, добавляют ацетатный буфер (рН 4,5) и навеску 8-глюкуронидазы 30000 ед. активности, выдерживают в термостате при 37 С, через сутки добавляют ту же дозу фермента и.держат еще сутки.

После гидролиза приливают 40Х-ный

Л0„„1328758 А1 раствор формальдегида, кипятят 2 мин, охлаждают, отделяют выпавший в осадок денатурированный фермент центри- фугированием. Надосадок сливают, экстрагируют двумя объемами смеси хлороформ — диэтиловый эфир (1:1) °

Образовавшуюся эмульсию расслаивают, как и весь экстракт, и объединяют с органической и водной фазами. Экстракт промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия и дистиллированной о водой, сушат и выпаривают при 40 С.

После отгонки диэтилового эфира выпаривают хлороформ,-освобождают от большинства липидов. В пробе мочи хроматографированием выделяют глюкурониды и сульфаты 17-кетостероидов, окрашивают их 2,4-динитрофенилгидразином, раздельно хроматографируют.

Затем фотоэлектроколориметрируют в микрокюветах с короткофокусными линзами. Расчет фракций проводят по концентрационной кривой, построенной после хроматографирования различных количеств дегидроэпиандростерона с учетом суточного диуреэа. Способ позволяет раздельно анализировать 17-КС, находящиеся в соединении с глюкуроновой и серной кислотами. В результате исследуют До 24 индивидуальных

17-КС, что имеет важное значение в оценке андрогенной функции коры надпочечников и половых желез.

58 2 колбе емкостью 50 мл при 40 С. После отгонки диэтилового эфира снстему соединяют с водоструйным насосом для выпаривания хлороформа. Сухой остаток смывают со стенок на дно колбы

5 мл метанола, закрывают пробкой и помещают в морозильную камеру холодильника. Через 14-1б ч метанол осторожно сливают в пробирку и выпаривают в токе азота. Таким путем удается освободиться от большинства липидов, Для более полного освобождения от липидов и пигментов экстракт, сконцентрированный на дне пробирки, растворяют, добавляя по 3-4 капли хлороформ — метанола, и наносят в виде полоски шириной 2-3 мм и длиной 80 мм на пластинку силуфола так, чтобы расстояние от боковых краев соответствовало 35 мм, а от нижнего — 20 мм.

Смывание экстракта повторяют до полного обесцвечивания растворителей.

На 1,5 см от экстракта с двух сторон наносят по 5-10 мкг андростандиона и дважды хроматографируют в системе хлороформ — этанол {49,5:О,S).

Места расположения пятен свидетелей проявляют, опрыскивая смесью 2 .7.— ного раствора — динитробензола в этаноле и 207.-ного раствора КОН в метаноле (1:1) при экранировании остальных участков хроматограммы. Сорбент от зоны расположения свидетелей и ниже, включая стартовую линию„ соскабливают с фольги, переносят в пробирку и дважды экстрагируют по 30 мин

5 мл дихлорэтан — метанола (9:1), центрифугируют„ сливают в пробирку и выпаривают в токе азота.

Для сальволиза сульфатов к моче после извлечения глюкуронидов приливают небольшими порциями 307.-ный раствор серной кислоты, устанавливая

РН 1 и добавляя мелко измельченный сульфат аммония до насыщения. Проводится повторная коррекция РН ЗОБ-ным раствором серной кислоты и смесь дважды экстрагируют по 20 мин равным объемом этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты íыдерл. p.ают о

/ в термостате при 37 С в течение ч8 ч.

После сальволиза дальнейшую обработку упомянутого экстракта осуществляют аналогично хлороформно-эфирному.

Для перевода глюкуронидов и сульфатов 17-КС в окрашенные комплексы к опытным пробам в вытяжном шкафу приливают растворы 2,4-динитрофенилгид13287

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к способам исследования андрогенов, и может быть использовано для выявления различных

5 вариантов превращения 17-кетостероидов (17-КС) в организме, обусловленных физиологическими и патологическими факторами, а также для целей диагностики эндокринной патологии. 10

Цель изобретения — повышение чувствительности способа за счет раздельного исследования глюкуронидов и сульфатов 17-кетостероидов, окрашивания их 2,4-динитрофенилгидразином, 15 раздельного .хроматографирования с последующим фотоэлектроколориметрированием в микрокюветах с короткофокусными линзами.

Способ осуществляется следующим 20 образом.

Из суточного количества отмеряют небольшую эрленмейеровскую колбоч1 у 30 мл профильтрованной мочи, устанавливают РН б,5, добавляя каплями 25 .2 н. раствор едкого натрия или соляной кислоты, и кипятят 3 мин для разрушения ингибитора фермента -глюкуронидазы. Пробу охлаждают, добавляют 20 мл ацетатного буфера (РН 4,5) 30 и навеску Р -глюкуронидазы, соответствующую 30 000 ед. активности, затем выдерживают в термостате при о

37 С в течение двух суток с повторным добавлением через 24 ч той же дозы фермента.

После гидролиза приливают 0,3 мл

40 -ного раствора формальдегида, кипятят 2 мин, охлаждают под водопро- 40 водной водой, отделяют выпавший в осадок денатурированный фермент центрифугированием при 10 000 об. в те.— чение 5 мин, Надосадочную жидкость сливают в делительную воронку, экст- 45 рагируют 5 мин двойным объемом смеси хлороформ — диэтиловый эфир (1:1).

После расслаивания экстракт сливают в чистую делительную воронку. При наличии эмульсии, которая располагается 50 в верхней части экстракта, ее расслаивают центрифугированием и объединяют соответственно с органической и водной фазами.

ЭкстРакт промывают насыщенным pal 55 створом бикарбоната натрия и дистиллированной водой дважды по 1/5 объема, сушат над безводным сернокислым

I натрием и выпаривают в круглодонной

28758 з

13 разина (0,03Х; 0,5 мл) и трихлоруксусной кислоты (0,31; О,1 мл), sbrдерживают их в темноте, сначала при о температуре водяной бани 80 С 10 мин, о а затем при 60 С в течение 30 мин.

Экстракты выпаривают в токе азота.

В отдельные пробирки отмеряют спиртовые растворы эталонов стероидов и переводят их в 2,4-динитрофенилгидразоны вьппеописанным способом.

Опытные пробы после предварительного растворения в 0,2-0,3 мл бензола переносят тонкими иглами (диаметр 0,30,5 мм) из нержавеющей стали с отшлифованными концами на отдельные пластины силуфола (15xl5 см) в одну точку слева на расстоянии 2,5 см от нижнего и бокового краев. В правый нижний угол на таком же расстоянии наносят эталоны 17-КС. Повторные смывания и перенесение окрашенных проб стероидов на слой сорбента повторяют до обесцвечивания растворителя.

Разделение 17-КС осуществляют в двух стеклянных камерах с притертыми крьппками для пластинок силуфола, в которые за 30 мин до хроматографирования наливают по 50 мл смеси растворителей: в первую хлороформ — ацетон (47:3), а во вторую — диэтиловый эфир — петролейный эфир (35:15). В каждой системе (вначале в первой, затем во второй) хроматографируют дважды, не доводя фронт растворителей до верхнего края пластинки на

2,5 см.

После каждой разгонки выдерживают в вытяжном шкафу 20 мин. Хроматографирование во второй системе проводят в направлении, перпендикулярном первоначальному, перед этим ниже опытной пробы на 0 5 см наносят в одну точку эталоны 17-КС. После разделения в 1-й и 2-й системе растворителей

17-КС с восстановленным кольцом А видны на хроматограмме в виде желтых, 4 а с наличием и -3-кетогруппы — оранжевых пятен. Идентификацию стероидов проводят при помощи стандартов.

Полученные фракции стероидов и равные по площади участки сорбента соскабливают с алюминиевой фольги глазным копьем, переносят в пробирки, приливают по 1,0 мл этанола, встряхивают 60 мин, центрифугируют, сливают в другой ряд чистых пробирок и выпаривают досуха, Затем добавляют по 0,5 мл этанола, встряхи5

55 вают и замеряют оптическую плотность хромогенов на ФЭК 56-М при длине волны 360 нм (фильтр Р 2) в микрокюветах (рабочая длина 4,99 мм) с короткофокусными линзами.

Расчет фракций проводят по концентрированной кривой, построенной после хроматографирования различных количеств дегидроэпиандростерона с учетом суточного диуреза.

Пример 1. Мужчина Ж., 29 лет, здоров. Суточная экскреция

17-КС составила 7,54 мг (глюкурониды 2,62 мг, сульфаты 4,92 мг). В глюкуронидах выделено двенадцать, в сульфатах — семь фракций. Наибольшая, концентрация андростерона и II-15-оксиандростендиона выявлена в глюкуронидах, а андростерона, этиохоланолона, дегидроэпиандростерона и эпиандростерона — в сульфатах.

Пример 2. Мужчина М., 38 лет, здоров. С суточной мочой выделено 8,59 мг 17-КС (глюкурониды

5,59 мг, сульфаты 3,0 мг). В глюкуронидах выявлено двеннадцать, в сульфа-. тах — девять фракций. Концентрация андростендиона, этиохоланолона, дегидроэпиандростерона, ll-P-оксиандростендиона, ll-P-оксиандростерона и

11- -оксиэтиохоланолона была вьппе в глюкуронидах, а андростендиона и андростерона — в сульфатах. В сульфатах не определялись 11- -окси- и

II-кетоандростерон, Л р и м е р 3. Больной Т., 27 лет, с синдромом Штейн-Левинталя.

С суточной мочой вьщелено 7,28 мг

17-КС (глюкуронидов 3,7 мг, сульфатов 3,58 мг; одиннадцать и семь фракций соответственно). Обнаружено повьппенное выделение глюкуронидов и сульфатов андростерона, этиохоланолона, дегидроэпиандростерона.и его производного — андростендиона, что можно объяснить замедлением превращения последнего в экстрогены. В то же время наблюдается увеличение суточной экскреции 11-кетоандростендион-сульфата. Это обстоятельство, очевидно, обусловлено отклонением направленности метаболизма андростендион-сульфата. Вместо эстрогенов андростенди он-сульфат в повьппенных количествах превращается в 11-кетоандростендионсульфат, Отмечается также повышение глюкуронидов 11-Р-оксиандростерона и

11-Р-оксиэтиохоланолона, что может

1328758 свидетельствовать об ускорении окислительного пути метаболизма кортиэола.

Формула изобретения

Составитель И. Емельяненко

Техред М.Ходанич Корректор С, Шекмар

Редактор П. Гереши

°

Заказ 3480/48 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий. 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Предлагаемый способ выгодно отличается от других тем, что позволяет раздельно анализировать 7-КС, находящиеся в соединении с глюкуроновой и серной, кислотами. В результате разделения глюкуронидов и сульфатов на 10

12 фракций представляется возможность исследования до 24 индивидуальных

17-КС. Применение микрокювет с короткофокусными линзами позволяет определять в опытной пробе с достаточно 15 высокой точностью небольшие количества (0,5-1,0 мкг) анализируемых гормонов. Выявление более широкого спект-: ра индивидуальных 17-КС имеет важное значейие в оценке андрогенной фуйк- 20 ции коры надпочечников и половых желез, в изучении особенностей метаболизма означенных стероидов при различных физиологических н патологических состояниях организма.

Способ определения 17-кетостерондов в моче путем хроматографии с последующим фотоэлектроколориметрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, as мочи больного выделяют глюкурониды и сульфаты 17-кетостероидов, окрашивают их 2,4-динитрефенилгидразином, раздельно хроматографируют, а фотоэлектроколориметрию проводят в микрокюветах- с короткофокусными линзами.