Способ определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного

Способ определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области биохимического анализа, касается способа ферментативного количественного определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного () и может быть использовано для анализа НАД в сложных смесях и различных биологических жидкостях. Цель изобретения - снижение предела обнаружения НАД. Способ осуществляется путем регистрации интенсивности биолюминесценции, возникающей в результате протекания трехстадийной реакции, катализируемой трехферментной системой, включающей НАЯ -зависимую дегидрогеназу, ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную люциферазу. Для проведения анализа к суспензии соиммобилизованных ферментов в буферном растворе при рН 6-7, отвечающем рН оптимуму действия трехферментной системы, добавляют субстраты всех используемых ферментов и анализируемый раствор, содержащий НАД. Предел обнаружения НАД составляет в измеряемой смеси. 1 табл, (Л со оо сд СП -vj

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) Д1) 4 С 12 Q 1/66

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4011170/31-13 (22) 29. 11.85 (46) 07.09.87. Бюл. У 33 (71) ИГУ им. M. В. Ломоносова (72) О, В. Лебедева, И, Г, Фрумкина, В. С. Ламзин, А, М, Егоров и Н. Н. Угарова (53) 577.15(088.8) (56) Wienhausen G., Deluca M. Bioluminescent assays of picomole levels

of various metabolites using immobelized enzymes. — Anal. Biochem. 1982, 127, )) 2, р, 380-388.

Meelroy W, D., Debucci M. А. Ferefly

and bacterial luminescence.— J. Арр1, biochem. 1983,. И 5, р. 197-203, Тишков В, И. Формиатдегидрогенаэа метилотрофных бактерий: иммобилизация и свойства иммобилизованного фермента,: Тез. докл. IV Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", 11, 1983.

1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИКОТИНАИИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА ОКИСЛЕННОГО (57) Изобретение относится к области биохимического анализа, касается способа ферментативного количественного определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного (НАД ) и может быть использовано для анализа НАД+ в сложных смесях и различных биологических жидкостях. Цель изобретения — снижение предела обнаружения НАД+. Способ осуществляется путем регистрации интенсивности биолюминесценции, возникающей в результате протекания трехстацийной реакции, каталиэируемой трехферментной системой, включающей

НАД+-зависимую дегидрогенаэу, НАДН

ФИН-оксидоредуктаэу и бактериальную люциферазу. Для проведения анализа к суспензии соиммобилизованных фер- С ментов в буферном растворе при рН 6-7, отвечающем рН оптимуму действия трехферментной системы, добавляют суб- фа страты всех используемых ферментов (А) и анализируемый раствор, содержащий

НАД+, Предел обнаружения НАД сос- ( тавляет 10 M в измеряемой смеси.

1 табл.

° ь Д (Р

1 133

Изобретение относится к биохимическому анализу, касается способа ферментативного количественного определения никотинамидадениндинуклеотица окисленного (НАД+) и может быть использовано для анализа НАД в сложных смесях и различных биологических жидкостях, Цель изобретения — снижение предела обнаружения НАД

Способ осуществляется следующим образом, Регистрируют интенсивность биолюминесценции, возникающей в результате протекания трехстадийной реакции, каталиэируемой трехферментной системой, включающей НАД -зависимую дегидрогенаэу, НАДН : ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную люциферазу, Ферменты предварительно соиммобилизуют на сефарозе, активированной бромцианом в присутствии 0,.3 М формиата натрия. Изменение концентрации формиата натрия по сравнению с укаэанной приводит к снижению удельной активности иммобилизованных ферментов и чувствительности определения

НАД+, Для проведения анализа к суспензии соиммобилизованных ферментов в буферном растворе при рН 6-7, от.— вечающем рН оптимуму действия трехферментной системы, добавляют субстраты всех используемых ферментов и анализируемый раствор, содержащий

НАД, Предел обнаружечия НАД 10 М в измеряемой смеси, Пример 1, Лиофилизованную BrCN агароэу 4В замачивают на 3 ч в дистиллированной воде, Полученный гель промывают последовательно 1 мМ раствора НС1 (200 мл НС1 на 1 г геля), 200 мл бидистиллированной воды, 0,1 М бикарбонатным буфером, содержащим

0,5М NaC1, бидистиллированной водой и О,1 М Na-фосфатным буфером, Готовят 3 мл раствора ферментов: формиатдегидрогеназы из бактерий

Pseudomonas Sp 101, 11 ВКМ В-1545Д— институт Микробиологии АН СССР, НАДН„:ФМН вЂ” оксидоредуктазы и люцифе— разы иэ бактерий Beneckea harveyi в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,5, с концентрацией белка 3 мг/мл и активностью 1000 мВ/мг белка, К полученному раствору добавляют 200 мг носителя и формиат натрия до концентрации 0,3 М. Суспензию перемешивают н качалке 20 ч при 4 С. Полученные

5570

55 с, 10

50 образцы отмывают попеременно кислыми (100 мл) и щелочными (100 мл) компонентами 0,1 М Г1а-фосфатного буферного раствора до исчезновения ферментативной активности в промывных водах, Отмытые образцы суспендируют в

5 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера, рН

7,0, содержащего 0,1 MM дитиотреитол, о и хранят при 4 С, Удельная активность полученных препаратов 200-1000 мВ/мг, Пример 2, Иммобилиэация проводится так же, как в примере 1, но инкубационная смесь содержит

0,25 M формиат натрия ° Удельная активность получаемых препаратов 20100 мВ/мг агарозы.

Пример 3, Иммобилизация проводится так же, как в примере 1, но инкубационная смесь содержит

0,35 M формиат натрия, Удельная активность получаемых препаратов 40200 мВ/мг агарозы, Пример 4, Для получения калибровочного графика в интервале концентраций 1 пм-1 мкМ используют одну и ту же пробу иммобилизованного препарата ° В кювету люминометра вносят реагенты, укаэанные в таблице, за исключением НАД и измеряют фоновое свечение ° Затем последовательно вносят по 20 мкл раствора НАД в концентрациях 0,125, 1,25, 12,5, )250, 12500 нМ, переходя от меньших концентраций к большим, и каждый раз измеряют интенсивность биолюминесценции, В данном .эксперименте при добавлении раствора НАД используют небольшие объемы (20 мкл). Поэтому не происходит существенного разбавления реакционной смеси и изменения концентрации реагентов при добавлении нескольких порций НАД в одну и ту же реакционную смесь.

В таблице дан состав реакционной смеси при проведении регистрации

НАД+ °

Калибровочная кривая представляет собой прямую в интервале концентраций НАД+ 1 пМ-0,1 мкМ, Калибровочную прямую обрабатывают по методу наименьших квадратов, Получают уравнение

Y =051x5,8, где Y = 3g (интенсивность свечения)

x=2g (концентрация НАД ).

Повторяют определение, вводя в реакционную смесь 20 мкл 125 нМ НАЛ .

Получают интенсивность свечения

Объем, Концентрация мл в реакционнои смеси, мкМ

Исходная концентрация, нМ

Реагент

0,1

0,25

ФМН в воде

Деканаль в 27-ном изопропаноле

0,1

0 5

Формиат натрия в воде

150

0,1

3,75

НАД в 50 мМ

НаН РО, рН 5,5

0,1 1000

Суспензия: 40 мг иммобилизованног0 ферментного препарата в 1 мл 0,1 M

Na-фосфатного буфера, рН 7,0

1,6 10 мВ/мп

4 ° 10 мВ/мл 0, 1

50 мМ Na-Фосфатный буфер, рН 6,5

2,0

Составитель Л. Борисова

Техред В.Кадар Корректор А. Обручар

Редактор И. Горная

Заказ 40 18/22 Тираж 499

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

)!р,н1 эээг по гв ээээг -полиграфическое предприятие, r Ужгород, ул. Пр;н к t н,эit

l5,7 мВ„ что соответствует концентрации НАД в реакционной смеси 0,91»

«10 M, Ошибка определения 97..

П. р и м е р 5. Калибровочную кривую для определения НАД при рН 7,0 получают так же, как в примере 4, используя 50 мМ На-фосфатный буфер с рН 7,0. Линейная зависимость между концентрацией НАД и интенсивностью свечения соблюдается в пределах

10 пМ вЂ” 0,1 мкМ НАД+, Пример 6. Калибровочную кривую для определения НАД+ при рН 6,0 получают так же, как в примере 4, используя 50 мМ Ма-фосфатный буфер с рН 6,0 вместо 6,5. Линейная зависимость между концентрацией НАД+ и интенсивностью свечения соблюдается в ,пределах 5 пМ-0,1 мкМ НАД+.

Формула изобретения

Способ определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного, предусматривающий регистрацию биолюминесценции, возникающей в результате трехстадийной реакции, катализируемой трехферментной системой, получаемой соиммобилизацией НАД+-зависимой дегидрогеназы, НАДН . ФМНоксидоредуктазы и бактериальной люцифераэы, отличающийся тем, что, с целью снижения предела обнаружения, в качестве НАД -зависимой дегидрогеназы используют формиатдегидрогеназу, процесс соиммобилизации ведут в присутствии 0,3 М формиата натрия и регистрацию осуществляют при рН 6-7.