Рекомбинантная плазмидная днк уе psg94,кодирующая синтез производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота,способ ее конструирования и штамм дрожжей sасснаrомuсеs cererrial-продуцент производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота

Рекомбинантная плазмидная днк уе psg94,кодирующая синтез производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота,способ ее конструирования и штамм дрожжей sасснаrомuсеs cererrial-продуцент производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии. Изобретение может найти применение в микробиологической промышленности и ветеринарии, особенно при диагностике, профилактике и терапии заболеваний крупного рогатого скота вирусной лейкемией, Пелью изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК YEpSG94, обуславливающей синтез производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота, способа конструирования данной рекомбинантной плазмидной ДНК и штамма Saccharomy- ces cerevisial АН 216 - ВКМ CR279D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов ) , содержащего эту рекомбинатную плазмиду, - продуцента производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота, 3 ил.. t (Л оо со NU

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

» „„1337408 А1

151) 4 С 1 2 N 1 5 /00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Г10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К АBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (57) Изобретение относится к биотекнологии и, в частности, к генетической инженерии. Изобретение может найти применение в микробиологической промьппленности и ветеринарии, особенно при диагностике, профилактике и терапии заболеваний крупного рогатого скота вирусной лейкемией. Целью изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК УЕрБГ94, обуславливающей синтез производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота, способа конструирования данной рекомбинантной плазмидной ДНК и штамма Saccharomy—

ces cerevisial АН 216 — В1iю1 CR279D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов), содержащего эту рекомбинатную плазмиду, — продуцента производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота, 3 ил.. (21) 4025079/31 — 13 (22) 02.12.85 (31) С 12 N 2792946 (32) 02.08.85 (33) DD (46) 15.09.87. Бюл. Р 34 (7I) Институт молекулярной биологии

АН СССР (72) А,А.Баев, К.Г.Скрябин, М.А.Эльдаров (SU), Зинаида Розенталь, Хельга Рослер, Сабина Брантл и Гартмут Ланг (DD) (53) 575.224.2:577.2/048 (088.8) (54) PEKO. 1ÁÈIIA11ÒHÀß ПЛАЗ 11(ДНАЯ ДНК

YEpSG94, КОДИРУ1011АЯ СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА

КРУПНОГО РОГАТО1 О СКОТА, СПОСОБ ЕЕ

КОНСТРУИРОВАНИЯ И 1ЯТАМ14 ДРО)КЖЕЙ SACСНА11011УСЕБ CEREVISIAE — ПРОДУЦЕНТ

ПРОИЗВОДНОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА

ЛЕЙКОЗА КРУПНО(О РОГАТОГО СКОТА

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

), >!) Изобретение отно-.,è ге я < ".:..-(с- с:х;!с логии и может найти при«вне:!и - (5 робиологичес кой громь!!(ц(е(3;!ости и 15( теринарии, особе»и(> tip((1.:-!л "-(с: т, ;<

ПрОфнпаКтИКЕ И тЕ р ЛЛИИ .>Л б Э.",Еi< >1!11»1 крупного рогатого скота 13 1эу Iloй ".; р кемией, Цель изобретения — созц-3!(и-:: щ(,1;—

Ма ДРО>(ОКЕЙ, СОДЕРЖаЩЕГО Р < )М() г!1!Л»:— ну(с) плазмиднук) )1Н(, кoòîp;3» кс>лирус поверхностный лнт»ге(-. В1Л i I ð» ку.п:— тивировании щтлммя обес>пс! . rrl;-;; с инте з производного белк -,;О(>о ((«<5((."1. )

С ВЫСОКИМ 13I»IXОДОМ, П р г(м е р 1 . Ко(! Струигк>15: 1:ir(: рекомбинантной плл эмиль .>S:. Я,: О-держащей фрагмент,!llll, . r»c . ::;> белка ободочки.

Схема ко»струи.>овл!(ия !II>с г(; т; !, I(r" на на фиг,l, > мкг ДНК пллэмиды реп; 26,, (or,е;—

ЖЯЩЕ Й фРаГМЕ<Н т Г(3НО « Я C i С f. Л .115 (>< Jil:,, gp >! и gp 30, гидрол»эуют р;--:с 1;>;!(< -;—

3OH 8g 1 1 1 33 I31«IC Of< 0 (OJI («r>0 . i б >>(,::(- Р; держащем 100 м>! NaC1, 50 м>" -г:.- -1 С l рН 7,5, 10 м)! Mg(:, « I к!)1, 1Тт! - 1 м(.

РНКазь(А в объеме 20 м л ii-.. r 3 С . .1::;—

1r л > ноту гидролиэа ко((,po>»fpyi! >:;< к-", Офорезом в агароэном геле, I.ок у«>»н.:: препараты обрлблтьп>лк>-.. с . г(>(!!":к 1(л-.— новского фрагмента )1Н "IQJ! .. (tpл->ы в этом >ке буфере с-. доблвлс- !. с>м рех д11Т(1> до ко»Ечной ко- <це»-.рлп(.!

100 мк .1, исполь=:уя 2 с д. с : э(!с:н;. л. и

Реакцию проводят при 20 С» те ":»

30 мин и инлкти-, ируют фер с !". »! >!": ванием при. 70 С в течение 13 мия, > < лученные фер енты с ..";!(ь:.11-:.:; <(»(.;:< исг(оль эуют д>эя п рис Ое-<.:.»1(:::: : .,;-(к синтетическ(!х г со!<: -??;!?????? ?? .??" ???? ccgaattcgc, ??.!?? ??????;; ?? ???? !??:??.!.> вОдят фосфорилиров(11(;.(с >0,. i< О> i. 1«вЂ” керл а буфере, соде ржлк(с . 6>:;трис H(1 рН 7,6 „10 м С1" l " ..". !

1 мМ спермидиг(л. 20 (м>11, - -" ". ), () 1000 С/ммо()«) 2 ..;:, -:;;.-; у 1(", кинаэы и 100 к(кг,) ."(л В". :>.. 1 е,>1: <„: > (« водят лри 37 С d течен»е объеме 5 мкл. За-е r J>, )б-1:;;(,It c

30 мин Ipz 37 С, Вк.)ек)ч зн»с i(!i сОс; а>3 .!!и((керл 1<он т;)Ол" .р )>к) " .с :.:> I: ;:; () обработки лликвоты реа:<цио(!<.Ой «е. и.

)< сорбирозанной на фил(.т",е <(,5! l ) М вЂ” ром, содер>кащим 0,,5 .П л,НГ!.1,.

Меченый препарат ли»ке;-:я >, 2С

BHOCЯТ f3 P(3ЛI;i(Ý СИЕСЬ .. О,: Л, )Ж:1

Hi<(-- 1 ст:>лг! ° е! тl; I.-.л 3ми.ri.< реп; 26

К О(I » л(Л -IО б()13:: t

1(.т, ((! . (. О» (1((Р; lilt

) >

)l; —.1!Г i,1>,, 3-;, > . Иl(ку— ни» г -(D()i,l)< !!1("«11 >, 7()сГ . (: (Г 1 (!1< л "Ill:> <) (3 я к(1 f >)1 .13 У! (. F> .:»»(т (я!ю- 1< > Ji» ld .11(()1< !cor(Bnt i б;—

-,О; l(,()»1: т 0 — 10 еп,>c, 3 J>ii:; I, j—

Кс !1 I 1! i» к:б! рую 3 . !(pi 3, >loJiiIО l, JI»! 1lpo:".лн-!я и гидроли 3л

-. :. тр»1<тл э-,й <()F:-. .,:1< р,-< к с Io>«ocrf 10 . ;>(г. т)ВО<1>ОР: "л )j <(ик .5(>: Р с лк ". и ) I if(1 ix Г и(! -., —:: ""..1- Л1, *1»,л I !(и " .1.1" 3 лил !» . !. r.-;:,; 6 J: л « " т) с « I 2 ) ", и и ".() <т е L>—

- Г<). и КО>««r>(rrri!:"

1 ." ".:-5. < „-Itг I, (Л1,; -> 1(? .т;>Оф",ре-3

3:)",)! 1:: г ..:.!) „ .(jp. -:: и <с т >л (ке

:; (г 1 <) "я (((3:<;1>!) л, 1(1! т О13,11 < .", 13 1 сг э е . i((>kl !,>Я С>!tс Е . РофОРЕ Э(3 ОПР >JlE у.-с>м г r: г(; »;1;ло! р 5, ))I!If,!»лес вы О (> С,, (O "1! (3 те (<3 „ )Ю

;:)::»г>)е(<:лм:Jill(р»-«." pом . 22 п.п, 5:>:; 1:<> < ((1: < Л 5 ) « 3 >.5 С 1

r, :у," «" «..ег.;л ie. I:0 ".1 МлС1, 11 1 у .>И>)

> (< «3F >rrr г(; °,(1>() (Етpт>(»т г, (i r rjl 0 лин, с)...tcp>»л>

СJ С > Г ЕКЛОВЛ;; ОС— (,>< > <т «,! >3«1< C«Jir«ог(31, О< Е

)); ...! „..:"! р.-:))у! ((рук)т) фильтру-тл ) л,;:-"!<э ".:I Iл":"::-(Оli»lйб J>015H—, »(,т<

" -ю- Fi = 30 мин

" "=с и .-::те

, 1>» » » > "< !,, >!!, );1> 1 Д .! >Ä1(>

;;.; 1;;»:::- —:, .:; т..:.".: яг).: 3 обье. ",>:!.<>у(ир:"..т 0 мин

< -))!5! ", .: .>"!< — »>; — К (>rr > ° т>(((т>O ЛЬ >);>« )>

=>

1(! ««-, 6 - !j,!т «о< 1, ! Р .>< 11 .>,) С " .-(- Э« - ° <.

) — )<Е >< -> r r«3 П „(., - „-1->.(-,OB "H 5

3 13374 в состав вектора рАТ1 125, содержащего терминатор транскрипции гена РН05.

Вектор рАТ1!25 (полученный в лаборатории генетической инженерии расте5 ний К1Б AH СГСР) представляет собой ппазмиду pBR322, в которую по сайтам

EcoR 1 и Hind III встроен модифицированный путем клонирования фрагмент размером 380 пн, содержащий 3 -концевую часть гена РН05.

После расщепления ДНК 5 мкг векто— ра рАТ1125 совместно рестриктазами

EcoR l и ХМА 1 в стандартных условиях большой фрагмент размером 4,8 тпн выделяют из препаративного IIAAI, осадок ДНК после эпюции растворяют в

20 мкл воды и используют для клонирования.

Реакционная смесь содержит О,! мкг 20 вектора; 0,5 мкг фрагментов, 50 мИ рис-НС1 рН 7,5; 1 0 мМ NgCI, 10 мМ

ДТТ, 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4; 1 мМ

АТФ; 100 мкг/мл БСА в объеме 40 мкл.

Лигирование проводят в течение ночи при 4 С. Для оценки эффективности встраивания фрагмента в вектор в качестве контроля проводят лигирование

0,1 мкг вектора в тех же условиях без фрагмента, 30

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli

HB10l, полученные методом обработки

СаС1 °

Клетки реципиентного штамма Е.со35

1i HB101 растят ночь на качалке в

5 мл УТ-среды при 37 С, "Ночной культурой (0,1 мп) заражают 100 мл УТсреды. Инокупят подращивают до плотности клеток в среде 0,6 о.е. при

550 нм и центрифугируют при

7000 об./мин, О С, 10 мин, Осадок переносят в ледяную баню (все последующие операции проводят при О С) и суспендиру- 45 ют в 50 мп стерильного холодного раствора: 0,05 М грие -НС1, рН 8,0;

0,05 М СаСI „, Через 20 мин клетки осаждают, как описано выше, и суспендируют в 5 мл приведенного раствора.

Через 30 мин инкубации в ледяной бане реципиентные клетки считаются подготовленными к трансформации их плазмидной ДНК.

К 0,2 MJI суспензии клеток (в стек- 55 лянных силиконизированных пробирках) добавляют 0,075 мл смеси лигированных молекул н расчете 0,5-1,0 мкг

ДНК на 8 10 клеток ° После последовате-1е>ной инкубации полученной сме c и в течение 25 мин в ледяной бане, 2 мин в горячей (42 С) и 10 мин при комнатной температуре в пробирку добавляют 2 мл УТ-среды и подращивают о культуру на качалке при 37 Г.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампио циллина в течение ночи при 37 Г.

12 случайно выбранных колоний трансформантов выращивают в 5 мл среды УТ с ампицил IHHQM и выделяют плазмидную ДНК. Культуры клонов выращивают г -пробирках в течение ночи. Клетки осаждают пентрифугированием при

10000 o6,/ìHí в течение 5 мин и тщательно суспендируют в 0,1 мл раствора 1 (0,025 .1 трис — НС1, рН 8,0, 0,01 М ЗДТА; 0,05 глюкоза), в которой добаsëÿþт лизoпим до концентраLIHH 2 мг/мп. После выдерживания суспензией в течение 30 мин в ледяной бане к ним добавляют по 0,2 мл растнора П (0,2 í NaOH; 17. SDS), а после осторожного перемешивания и выдержио вания еще в течеHHе 5 мин при О С

0,15 мл рас.твора III (3 .! ацетат натрия, рН 4,8). Вязкие смеси слегка взбалтывают, инкубируют 1 ч в ледяной бане, а затем центрифугируют 15 мин при 10000 об,/мин. К 0,4 мл супернатанта, переносенного в новую пробирку, добавляют по 1 мл 987:-ного спиро та, смеси охлаждают 10 мин при -70 С и центрифугирукт !О мин при

10000 об./мин, Осадки растворяют в

0,1 мл 0,3 М ацетата натрия, к растворам добавляют Ilo 0,3 мл спирта, смеси охлаждаюi и центрифугируют как описано выше, Осадки промывают спиртом, сушат и растворяют в 20 мкл Н О.

AnHKBoTbl растворов ДНК анализируют эпектрофорезом в агарозньгх и полиакриламидных гепях до и после гидролиза ДНК эндонукпеазами рестрикции.

Гидропиз 0,5-1,0 мкг ДНК проводят

0,5-1,0 кд.фермента в !0-20 мкл инкубационной смеси в течение 1-2 ч.

Плазмидную ДНК рекомбинантных клонов анализируют с помощью рестрикционного расщепления эндонуклеазами

Baw H1 H Pst 1 (в высокосопевом буфере в стандартных условиях). Клоны, содержащие фермент гена gp 51 в векторе рАТ1125 в правильной ориентации по отношению к терминатору транскрипции гена РНО5 образуют по два фрагмента при расщеплении плазмидной. Ц1Е ре«трик r;1.»<>é Влм 1 1

1,2? тпо) и Ряс . (, 3„,6 т

ЧТО ДОК<Ч 31!1» 1« (< Я » 1«I ()« !<- ) )! р o:(и 3 л то н l i J(;1 3 и f <,,и о и . 1: ., ГЕ:(Е, II р и м с. р 2. Е< }и

pe}:1 <) 1,1 »! ..<;)Ä! -), -),, <) >

1IJI I К О} I « 1 p>) И() ОИ л}(1(" ) с ) най плл Змичli, « .;а!. О<>} <>Й ft;: !,) " ">I- ) синте»:1р<>и »н<);(ноl а г <: ??;1 !>f!<)-I,)!)f

В01 !» к.(етках д,)<;>r-,q;«! !. „;» «) ) фу}1}<1(ИО Нсlэ(Е! IIO 1 < > " .< I< O;) <) > <>1) > < 1 " » фрагмент,)1!!(q илл»мti;t! I I>,Ê» -Н < част(>}<) генл <„)р > I:-! . р fi ir::.": . . тра(7 «к!))!«ка 1!I! I f !«:) If ний И. 11> Л)1 <:001 > < ) д: !)

TeJIh}I<) <.ТI> <. I I I 1! !. (" !In: Л If < I r . 1<1 I! !) мо Top!:()(и ф )л I r".< .(т 1 с 1! ! I " „, !,>< и!. ляс т «об

J(o}»nòenr.нос тr. C P<>Ñ "с.. >1! >: .;: < .: 1: нуклеотидоl! кoTonoи пэе;!«1; .. !." бой учл«гок рлс!<(с >д«н! я .;.; - и;!к тазы Н< ОК 1.

0хемл 1

YFpSG9-> принеденл пл +и-..

:1НК i. à зм!(;;и р50-Я3 -,)лсэ!е in f

«Т а НД Л P . 1,})Г . У .."! С! < f 11 Х Р «, ., ) 1 ".;: .::

ВсоР. 1 и Н j nd 1 1.,

Иэ и;1л <»Не(ГЕ),! рЛ Р . 1) i ") (<> I 1) ;.,,I f

1»ам е»1)гееляют В,(!г! Н l — В< OR фи:.. <1;;

p

) 0:.(к: плл.»IIII;il(n:. . . . .: «к

УЕр)3 гидро.(из< !»Ии}1,:! ми Ваг(} Н) и Il nd 1 I l !> < «>и:л)- !! ( услое»иях p=3ne:<яю-. э,<с<к "! 3!) )!) ):! :. н 1 -ном лглроз!<Ом . е.(е

IHI(;)a3.ìåpo..I 10> 3 !(н г,к(д : .:-,л!. обычно пр}!и ято .

)!и ирл(эл}11(е 1»ек -.0 )}fn! <) 11 1:; >)

Hind 111 фрлг»!е . га «,-и:>;1, 1<)и.!-) мыми фрагмс !(та((и >3)лгп II I — !, .< В и

IcoR ) .- Hit;d 1 I I po): )! я, кл!с слно я примере 1 с,и<.r}:)}т >чс>;;!ни<"!

О, 2 мкг нектара> и .—.о 3> 3 .;! "1:!!— мента(» ралли:(аю}аи»игс a .—.»I(:;ар ч(ру.ют ком}(е геитные к-)e гки;}} лмм< ".: <) I .

НВ ) 0).,Отбираю- трлисф >р (л;-. -31 . )>< отипом .,1 .11+И .П+ТГ . 1 -., !!11< и:.ссо:.-: 1<»о..::}}о pi !б>3лн н})(õ 1 <) кл Оное» 3(<:, <, I <-;f<>". моща I<1 м<»тодл (((<- 31<>чи)11! .)К< "},::,1}))!

) f; . ) f; ) . ) Ид!: f <

1> 1) -., )

>, )) . 1;! !

1: 1! >! (д > ..,- "., ) .))! 7,; -: - :,1; 1) < !, .) .,: " )I !,: }к . (И 1»: I: )! .«, 1 "i "«

1: f!< Иl!) !! . ) ; 1. i ")

) ) !. 1! ); )! )»f

<. <) < :. и )! и .: <

Г.))!

> г

)!) !

l «. P! .!

1, ";: 61

<?! :.! Д< i) .!!>: !). — )! <) <) л I! <)

;> !)Л; )", ) .1, I .)f > Га < -;, - .>..., .;! f .:)), >;:,;,», .:,:,!»".< Ч»

«1-,:, -; » ;; --«; I),)11, fr "— !

) ) f! б), .", - <><) -), )с

}(! )), <)

- ;1 <»!,)0)

" (С- f (;1:.:

»,ч), .:;! л "(и ) а—

Г )

» :iН (,);» >!!,.« t), ");, ;Г><). !.!!);!);" -: ..«:f);(ы I n) Y<1)<:p<>»f, . м,, 0 ) »,. l7

Ie!)и I

)) )f) )>, !) ), !)): ) !)! .))! !)!»< ) 3 < Л! 1,, 1 !! >« I 1) )f I . . I 1 р f »» <;:. I I .I О, 3 !!<>

:< "...1.- . -,; +, 1 )<) ))< (! !)> (с .1 !., ),, ° и . -,> 61! I33i ( исходноl ë объ(мл в буA(.p(, гоц(р!},л— шс1м О, 1 .1 Li Gl . Инкуоируют 1 ч llpH о °

30 С, после центрифу! ировл!1ия а; лдок клеток суcïåHIIHðóþT I» тîlf ж«с уф«р« а

», и Koftöåf!трлции 3 х 10- к I(ток/м1п1, К 200 мл суcпензии к IE TAF; приблв— ляют 20 мкг пллзмидной ПНК УЕр8(94

H 400 мкл 50/. aраствора П.3..1 . 4000, выдерживают 1 ч при 30 IHH. пос.(е о, инкубируют 5 мин при 42 С. Cycll(.нзи(о осяждлют центрифугированием 10 C «p»

10 тыс . аб . /мин . Осадок cyclteftattpy— ют в 300 мкл воды и высевяют по

100:мкл нл ча(яки с твердой се:1ектив — ) В най средой (0,67Х дрожжевых азотистых осно!(аний, 2Х глюкозы, 20 мп1/ч гистидинл, 2Е бактолгара) .

Колонии трансформантов пая1»ляютcFt на 2-4 день пос IC посевов, . !итот:.!†20 ч«г.кую стабильность п IB3MHpII YEpSG94 в транс(»ормантах определяют клк 1:роцент клеток, сохранивших пллз»иtä( при росте в селективных уc!IoâFIF!»: минимальной среде без лейци!1л, 0-..об— рлнные индивидуа IF íbtå колонии 11(.рв1 чных трансформантов переносят штрихом ня селективнуlо среду, и пас:1е роста с клеток при 30 С в течение 12 20 культуру клонируют нл полной среде 30

УРО, Выросшие на полной среде инд .— видуальные к-toHEI затем повтор . о:1ере— носят на минимальную среду для определения процента клонов, сохранивших прототрофнасть по :(ейцину, 36

Определенна я таким образом и 1та— тическая стабильность плазми.-ы

YEpSG94 в штамме АН216 саста ..1яет

75-857 (среднее из 10 определе 1ий), Пллзмидную ДНК из трлнсформлнтов штамма ЛН 216, выдLëÿþ» следу»о!1!»м способом. Клетки, выращенные в 200 мл минимальной среды без лейцина,центрифугируют и тщательно промывают водой.

Промытые клетки инкубируот при комнатнойй температуре в теч«1(ие 10 мин в следующем буфере : 0,64 !1 меркаптаэтанол + 0,1 11 трис + О,I М ЭДТА

08 8 н 1 . 1 ((1(»(«толе и:» ость(зь(е 5 м!1 (ор-. б)(тo:lл 1» f,1(1 « loT 1111, Полученной -I!IBBF!èäíoè .ЦIК транс— формирую г клс -. ки Е. co 1 i НВ 101. Из тех же трлнсформлнтов, которые BE Ipoc ли 1»л среде YT с ампициллинам, выде. I я ю т и. I л 3 ".I иди y fo, (! I I(p л с Iп е пл яю т л р и помощи ферментов рестрикции FcoR 1

Hinc1 III, Ham H1 H $л1 6! и после рлзпеления продуктов расщепления в

1, : †н лглрозном геле доказывают

cTpóI Tóðíóþ стабильность пллзмиды, выделенной из дрожжей. Полученный штамм, †;1родуцент производного белка оболочки IILV депанировл!! во Бсесою(»най коллекц ги . 11н(рос рган11змов ИБФ)1

: (Н СС(;Р 1 сд 7- CR280;! характеризуется сл«д(Iо(цl(м11 ..pl! знаками: . lop, .;î.1 оги есl(1 .е признаки: вытяну11 е р и 1 оч1 о1 11 (ы(Грл.1 от!!ицл тель ные > нс coîðó.-п(руюнп1е клетк11, Куя!,турл. †.ьные признаки: клетки хорошо рлгтyò нл обычно ис.пользуемых питлтсл. ги-ьх с репах. На 1,5ã.-ном nuTBтгль1 ом лгяре "Дифко" образуются г 1адк11« с «рыс, блестящие круглые с ровным к . IåF: кс лании, При вь1рлшивани1 . г ж11дк;1х Т- и LH-средах возник а е-. ин т«нс !1вн ля мутность .

Ф11зиологг-б»ьэ.-.огические признаки: апт1(ма.—.l. »я те..(пературл ку:!ьтивиравлн11 37 С, агт»к»1ум рН 6,8 — 7,5.

В кл ес-.BB;1с-.очникя углерод" можно испаль зоват! многие углеводы. орга1»ические к1 слота., спирты. Источником азата с..1ужлт м1гнерлльные сали (в аммонийной !гли нитрлтной форме), орга..ические соедин«1»IB (в виде пептона, тр!1пто»»л, лм;!в«кислот) .

Ус той 1Ш»o cт. к ачтибио тикам: прая:»ля!о-. устой 1ивость к BMIIHIIHëëèíó (50 мкл/м.1), Вг е штаммь1 дрожжей, несущие плазмиду УЕрЯ(..94, характеризуется следуюЩИМИ ПРИЗН»;. »;Н, . !орфологические признаки: клетки имеют форму от круглой да овальной, (8,, 0), 50

Затем клетки центрифугируют и мноI (и(ратно промывают буфером, состоящим из. 0,126 1 NB.НРО + 0,56 М (1Н „)„80, ." 0,062 с1 цитрат, и ресуспе дируют в этом же буфере, Далее гледует 1-часовая инкублция в присутствии 10 mg Еушо1аяе 5 )О клеток о, при 30 С, Протопласты собир lloT погле нентрифугировяния, промывают дважды средах, На 2-2,5i-нам агаре "Д!1фка" абразу1отбелые колонии с ровными литл тельных питательном ся гладкие, краями. При

YEP0 H УЬВ-с выращивании нл жидких редах появляется интенсивная ровная ьlóт!!ость, Физиолого-биохимические признаки: оптимальная температура кульTивиропри делении по»!кую!1!неся.

Культурлльнь(е признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых

>дом г»3<-рдоф 3»

,;!.i ирли )!3()II;Iо! < ,> т, 1с.

3И! Ti))r)MOтс)рл кг ". мкг,?бп,с . ::(;B,ет О..? : с

»c:(кл к. .: т и, :.1 с> c ;> 6 т

)?<ПЛ«МЫ»! ПРОИ ) . и i(<»(!. !!!) б. p e Т (.) с: И я < у »(ванин 28 — 30, оптимt M .)(l 6, 6 8 качестве источника уг::pðo,H;, с,(>(H гп< ?вным обр;(30М 1 лк)коза, ." »?с)кл случаях спирты. 1!Сточникс>>! л.)л-. л жит (NH ) „80+, орглни ескис -..OE:.-(И(t. ния (в форме пеп-.oHý, амин: к не(:лт,, П р и м e p >. Тестирл )ание зк<— прессии производного белка лбо; с>чки

j3LV н пизате штлмма-ироду(:, нтл, Для тестировл:.ия зкспре:.-..Ии ..р.— изводного gj? 51»> трансфор: кро»3! и. л. штамме Л1(216 лдноврем<тнно я::ри л;:1(—

Hf3KOBbtK

TPr3HCQOPMHH TOB H C»30r) 0jIHbI?r:) T i! J>.Л -миды штамм реци иентл I) 1 м.? "ПГ-,:;.", :

r>

К У>?»т ТУ РЫ > El f>IP Л IV«»t H O TT В Г P. I " "К ". I l В H (. и

Среде с 1, > г J Jl K — PE, 3»)ojt!? ":н 1 0(:. полной среды без флсфлтл, ;0 дро>кжен 01 О эк с т рак тл,. 1H<1)K o .", О бактot?< птонл рле г»)лряк> г }l ..1 во.?н: до конечной клипс tt? рл(",ии О ., 3ч . 1. получ>е»(»30(!ч рI(т»3()р lлбл»!,T ?I)T I н? перемешинл нии;)мил лк д:) т(1 3<«к «в нечной концентрации. П >Гпс -;, лв;— гo перемешлвлния lip!1 к(>)и(л! с;й г(",:"

Р<Ч ТУ)) «Р;IГ ТВ ЛГ) фИЛ . 1 j) > f<) T О: .> (1

})л»()т 1((, доводя pi(дл 6, !<)(p -. >!IY>

3 М слц()тлтл »(,1 1 рия (p!I 6) ) к Г;(«чв нлй Ko»tljp»ròj>1)((ии 0) 03 .()i р с: !».р токллвируют. Пллуче(шыи и(.!с раствор рл «б(1»33!»!»>т» 1 р,i? I цлбл»!;

)ОТ 1 ЛЮI<О-)Ы ДЛ К(>НС iflO(r:. »((;> Н и;i ITI

)7< ТЛKЛЯ Гj)C >,B .Г(1()>(1 ". > Т>Г . (1 »с!

КУГ(»>ТИ»>И;>01<«IН?(Я -P" К>К(т» )(» И.IK лереt?pc с(HH ((р(>мл. Орл гена 11(0!—

Плр;IJ>jtpH «Но ныр;пякнспвг I (О трансфлр)!л .;И(>е:.с:л-t купь-..v1)b: р;)(ф;!"» rr

СОДЕPJ»:Щ«й М)И;ИМ;.!1,!(О)«j)r ij(,О,!), 1 1(1!3 + ",, клю!; >!? + !0 1(11;/1, . It" г(л l— и;1) . ПОГ.-(е 28 — 1»IГ 1»)л) . )(}(к,(:,!(:-:,;.. ((ре

28 0 )!(! (учли: ОГ)дки .: »(лр "J: < I iibl" купь 1 уг (пу (»«и ("(>I ри<»>уги ), . >) 1! 1!)>

ПРО !»>II) <1K) I Iiк .») Л rj(? >(. HC:IO»: >т(J»>) 3; (:! >!

II0JI ) Че}(ия Про: еHHOB(го >(И 3!1 ),3, Ij!".

ЗТЛ ГО !\ Л(. Лд}? у )об >Б ПЯIВ I,т!i . O! T < . .I, 30 и .! .iлР; (рН 7 ) 2 J; к»г! »8). рлнный лбъе)! Гте» ляп»п.;х »ял,)l K;?B !д) л

MpTp c> 0«<) > ?л О, ) м>I Hl! (г <>(> T FI( перемс !!(И»3(3»() i нл м и Гере (.? -1: ».)) ПЕРИОДИЧЕ?СККМ ОХС!Л)»„-. Нri(! В П: Д:.;- " блие, .)»и 3(lт»(ц(и гр> фу(Ipó»c I -:.тл

ВОПИТ К ЛТдс? !«НИ (> IC Ï(>т >теlr) I > дс по И

СЛ И Ст«КЛяННЫХ ШЛрИКОт>, Оу;1С«.:>»(Л-.:31 т

ОЧИЩЛК)Т»1(?13 ".ОР»?Ы»! ЦЕН >" РИфУ) -! P»Á Л Н 11(."! цен три())уBP "3(?;IPH)qnpc(><1;" >

Белок, который янляется прок ВодHbIM jyp 5 1 опре?EC JI»IK>T E) !TH 3л глх (;" ) .".jA, :0»(це}31Рл:»изл те штлм— ст . Г C) 13 И»? Х Д Е П Р Е С цл Р1 0" i 00c? ":нляе1

> л г(?(кл. чт« . оот—

r! (1;Š—.0 РЛГ T (3(?PHMO! ) .1 r> «;> () . . " Е» И . "1 О. 1 Е К У! I т >! i О Л 13 P Г Л j > О; (y К с. . > К Г 1 P «С Г И H

> )- I ОО мкг (уммл;>нс>гл бе IKI ли. )атон >)(Х if(> ñ! М 10 E Н Ь") Л :fC H: —:b(K К >К О:!И СЛНО

; ";T «р< ") ):;I.„е Htc> ...е то::ом диск— ))»ф()) « =.:i В . 3:- — !М 1 ..(одн и>к

>с 1 б< »1, !)»3 В. 1 ЕП, » РО»!?1») т >Т ПЛ . -к(: »(?(е! B,K«ðoí . 0", iy ttc»о! ин,.

1". >(< I< P, (т»Г t (<?.1 )" ИН y (((>:t . y»В" т )>.»« " IIB liH (>OH()

i!J!!) )т)»!1 ф?Г) . г» 1;>« i«>»ср«НЛ, Л

1: (»:- р > ) б ) >;)л;-. " ь н:> к ";:. f i . и г < и л M T (l l p 0— т,,, 1), „(,е, »(.; г, т,,<>., (,,JK

:) и(:- () в !(р:(ме 1)(-.,: .,;1»3<.;>B;.K)". лн—

lt!>1 );»1)и((.1>l(;IJ"! 3 Лli, I !.-(И" f Гафин ПСК; 3 ?J., :(; «K тиР > )»! г" т("", "!,f j>H IH 3;! IJHH ,:! Т;1! Еjl!i>:1 и Л . К")Mi: ° Ilp КОВЛЯ 3(. ! Л .I . «O Г )ii )! 1!r <> )> . -, . j t>(«Т < 13 )К"". )> 3К I (> 1(>):! > т!(«НH!> .! H 3, .- ;) >)(f, > тс ".т ",(g (1»,;,(>(« ° »(л .! тт »""1 Як j!c (1 .>(, Г J:H . 0 . р«де (:.* Ilцй

> < > Г » ») }! > (>) )I . .л >IB H!KF) лс 1 1! ) Ой з() !с !)>ке)!(l« I « iркt ))1(}>)х бс пкс)}3 <о—

<(;т>(!.)1! I >" (; »;! - К !:: «»< С П С) «Г C HH !!); !l(! . : с, !!» . . ; 1» < 1 ГTBy CТ ((l! Е;(: I.»!(:.? ", II-JKJ-.< . -1 Ной IIO< -1(>в с:: ПОГ":: ., !j;B:.:,:. }I ..(1!!, с»перв

"!: p !-> (9 >-, р:) .> ."! e p

".»1: и>,!(-?1;) (C ! (К Д, >К".(1:, >. . -)»>iI >с )! :I>. : II;i Я . » ..,I,:13 ) >3. .»JОГ i Ь

;)Л.)i (.:!i»:! С !;::;) C>C".КЛ

)>»< >J )",(! 26(3 1 )!:"OKH .)О, J3<« (:> ir K >) (Я(>iiO;) Ir(. <;- !1(B» Л (! . ") f!с )HJ >!r Ета!(»(Я.

° jr! 1 . 3".;вI:>»И lj »:11>K !JP с (ИН Г« (3 » !?;> . .; I j) C т Ей,",. С )IB IH

Г!il>K» 31!J!.lr>OЕ .»1)(l>;.,,.: t М «(<.

K;) .li!Ir: г :,:: н !!; ?(генные

"»;.;r »(Т!., >7:

Рс ко !би ан1 IB!r илазмидная 1НК

19; 9((>»<од?(1>у»оща»! "."èíòå 3 производ: С .J:К Л Об 1.10 «KH 3 J?j УС с= . ?Е ЙК C):3 1

1337408

20 крупного рогатого скота, размером

11,9 тпо, состоит из следующих элементов: большого Bam Hl — Hind III

5 фрагмента векторной плазмиды YEp l 3 размером 10,3 тпо;

Xma 1 — Hind III фрагмента реконструированной 3 -концевой части гена кислой фосфатязы дрожжей, раз- !О мером 0,38 тпо, несущего сигналы терминяции транскрипции;

EcoR 1 — Xma 1 фрагмента модифицированного гена гликопротеида

gp 51 BI V размером 0,63 тпо; !5 — Bam Hl — EcoR 1 фрагмента реконструированного промотора гена кислой фосфатазы дрожжей, включающего последовательность сигнального пептида, размером 0,6 тпо; содержит:

1 участок расщепления рестриктазы Hind III;

2 участка для рестриктазы Xma 1, расположенных на расстоянии 0,380 и 6 тпо по часовой стрелке от единственного Hind III сайта>

2 участка для рестриктазы Bam

Hl расположенных на расстоянии

l,07 и 1,67 тпо по часовой стрелке 30 от Hind III сайта;

2 участка для рестриктазы

Sal 6!> расположенных на расстоянии 2 тпо и 7 тпо по часовой стрелке от Hind III сайта;

bla-ген, обеспечивающий синтез

g-лактамазы (устойчивость к ампициллину), расположенной в участке от

3070 до 3930 пар оснований вправо от Hind III сайта;

leu-2-ген, обеспечивающий прототрофность по лейцину дрожжевого штамма — продуцента, 2, Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК YEpSG94, 45 обеспечивающий синтез производного белка оболочки BLV под контролем дрожжевого промотора, включающий выделение фрагмента, кодирующего часть последовательности гена яр 51

ВЬЧ> содержащегося в плазмиде penv 26, обработку фрагмента ДНК-полимеразой 1 (фрагмент Кленова), присоединение к полученному фрагменту синтетических EcoR l-линкеров, расщепление фрагмента по внутреннему сайту Xm 1, введение с помощью ДНК-лигазы полученных фрагментов в векторную ДНК рАТ11-25 по сайтам EcoR 1 — Xma 1, трансформацию рекомбинантными ДНК штаммов Е,coli, отбор клона плазмидной ДН!< р8083, содержащей последовательности геня gp 51 в правильной ориентации по отношению к терминатору транскрипции гена РН05 дрожжей, введение EcoR 1 — Hind III фрагмента плазмиды pSG83, содержащего часть геня gp 51 и терминатор транскрипции гена РН05, и Bam Hl — EcoR 1 фрагмента плазмиды рА53> содержащего промоторную область гена РН05 дрожжей и последовательность сигнального пептида, в рекомбинантную ДНК бифункционального вектора УЕрВ расщепленного по сяйтам Ваш Н! — Hind III, трансформацию рекомбинантными ДНК штамма

Е,coli отбор кпона, содержащего модифицированный фрагмент гена яр 51

BLV в составе бифункционального вектора, окруженный сигналами инициации терминации транскрипции гена РН05 дрожжей, осуществляемый с помощью рестрикционного анализа.

3. Штамм дрожжей Saccharomyces

cerevi.siae ЛН216 YEpSG94 ВКЧ CR

Ф 280Д вЂ” продуцент производного белка оболочки вируса лайкоза крупного рогатого скота.

I,,,о ":.ии r, :кро:;;1.,/

Релгск тор .1. Ток т, и

РР" > " I ;I.1 с РОсИ

Заклз 409/ /23

" .i "". .р И с К

I/III IGII I !1 . с;(:i j) . гii (и и о::. /:: i t,",Рс. I по ло.си .11(iрс: . ii ..; и к:)i i ãи 4

I i ЗсП35. Мое;ил, . :,— 35,",. " ...,. с ос .

1 (Произис1ггстиеиио — и;.ииг и t|ll: ..окс е и :с:.I::; II, . .с. i, . L. !.> >с к с и;i5: