Способ получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза

Способ получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лабораториях и НИИ, изучающих механизмы формирования противотуберкулезного иммунитета. Целью изобретения является повьшение эффективности способа получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза. Сущность предлагаемого способа состоит в дезинтеграции микобактерий в конце логарифмической стадии роста (через 16 - 19 ч от момента начала культивирования). При этом концентрирование и очистка полученной иммуногенной фракции осуществляется в оптимальных режимах промывания и центрифугирования. Полученные при реализации предлагаемого способа иммуногенные фракции.микобактерий туберкулеза обладают выраженным протективным действием при их однократном подложном введении морским свинкам. 3 табл. а S (Л с

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

5 А1 (19) (И) (д) 4 А 61 К 39/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ7ЕНИЯ

К А BTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4015472/30 — 13 (22) 12.12.85 (46) 23.09.87. Бюл. № 35 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт эксперимецтальной ветеринарии им. Я.P.Êîâàëåíêî ,(72) В.С.Гуткин, А.П.Востряков, В.А.Горбатов, Н.П.Овдиенко и P.À.Цапко (53) 616.002.5(088.8) (56) Романова P.R. Использование дифференциального ультрацентрифугирования для выделения субклеточных компонентов микобактерий туберкулеза. — Проблемы туберкулеза, 1981, № 7, с. 54-56. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНОЙ

ИММУНОГЕННОЙ ФРАКЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕР1(УЛЕЗА (57) Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лабораториях и НИИ, изучающих механизмы формирования протн" вотуберкулезного иммунитета. Целью изобретения является повышение эффективности способа получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза. Сущность предлагаемого способа состоит в дезинтеграции микобактерий в конце логарифмической стадии роста (через 16 — 19 ч от момента начала культивирования).

При этом концентрирование и очистка полученной иммуногенной фракции осуществляется в оптимальных режимах промывания и центрифугировання. Полученные при реализации предлагаемого способа иммуногенные фракции.микобактерий туберкулеза обладают выраженным протективным действием при их однократном подложном введении морским свинкам. 3 табл.

38859

1

l3

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лабораториях и НИИ, изучающих механизмы формирования противотуберкулезного иммунитета.

Цель изобретения — повышение эффективности способа получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза.

Пример 1. Проводят посев микобактерий туберкулеза (после 3-5 пассажей) на жидкую (например, Сотона) и плотную (например, ЛевенштейнаЙенсена) питательные среды, причем в последнем случае в большом разведении (1:640 — 1:1280) и помещают в термостат (37 С).

Ежедневно определяют количество колоний, и по 1ор от среднего числа колоний строят кривую размножения (табл.1).

Основные стадии роста микобактерий туберкулеза бычьего вида приведены в табл ° 1, В соответствии с полученными ре— зультатами бакмассу БЦК для дезинтеграции берут через 16 сут роста, а бакмассу N. bovis (данного штамма) через 19 сут роста.

Для получeíèÿ фракции оболочек микобактерии в конце лог-периода роста подвергают механической дезинтеграции в соответствии с параметрами, приведенными в табл.2.

В качестве среды для суспендирования используют физиологический раствор (рН 7,0 — 7,2), в который вносят бакмассу, после чего бактериальную суспензию посещают в камеру дезинтегратора, куда добавляют стеклянные бусы. Камеру дезинтегратора охлаждают в ледяной бане и проводят разрушение микобактерий туберкулеза в непрерывном режиме работы. По окончании процедуры разрушения надосадок переносят в сборный сосуд, стеклянные бусы дважды промывают физиологическим раствором и объединяют с ранее полученным дезинтегратором. Неразрушенные микобактерии и крупные конгломераты удаляют центрифугированием при 2000g в течение 20 мин. На— досадок собирают, осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют при тех же режимах. Эту процедуру повторяют дважды, полученные надосадки объединяют и центрифугируют при 15000g 60 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в 0,5 -ном растворе тритона Х-100 в

5 соотношении 1:50 при постоянном перемешивании в течение 10 ч (для БЦЖ) и 18 ч (для М,bovis) при 4 С.

Цитоплазматические структуры удаляют путем центрифугирования суспензии при 15000g в течение 20 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в 1N растворе хлористого натрия в соотношении 1."50 при постоянном перемешивании в течение 13 ч (для БЦЖ) и 18 ч (для М. bovis) при о

4 С. Обработанную суспензию центрифугируют при 16000g 20 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и центрифугируют при 16000g 20 мин. Процедуру отмывания клеточных оболочек повторяют дважды.

Чистоту полученной фракции оболочек контролируют цитологически и бак25 териологически. Оболочки лиофилизируют известным способом.

Пример 2. Приготовление

1 масляно-водной эмульсии оболочек микобактерий для иммунизации животных.

А, 10 мг лиофилизированных оболочек микобактерий туберкулеза тщательно перемешивают с 0,25 мп стерильного вазелинового масла в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком

35 и по каплям добавляют 9,75 мл 0,5Кного Твина-80 в физиологическом растворе.

В результате в 10 мл масляно-водной эмульсии содержится 10 мг оболочек, соотношение масла и воды 1:39.

Б. 10 мг лиофилизированных оболочек микобактерий тщательно перемешивают с 0,20 мл стерильного вазелиноного масла в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком и по каплям добавляют 9,8 мл 0,57.-ного раствора

Твина-80 в физиологическом растворе.

В 10 мл масляно-водной эмульсии содержится 10 мг оболочек, соотношение масла и воды 1:49, Пример 3. Изучение протективного эффекта оболочек БЦЖ и М. Ъоvis на морских свинках.

Приготовленную масляно-водную эмульсию оболочек БЦЖ и М. bovis вводят подкожно морским свинкам в область медиальной поверхности бедра однократно в разных дозах.

Таблица 1

Стадии роста, сут

Микобактерии туберкулеза

Лог-фаза Лог-фаза Стационарная фаза

С 17

12-16

Mycobacterium

bovis 8

С 20

12-19

Таблица 2

Стеклянные бусы, диаметр

0,1 мм

Соотношение бакмасса: физиологической раствор:бусы

1:1:2 з 1

Протективный эффект противотубер- кулезной иммунизации морских свинок приведены в табл.3 °

Одновременно животных тем же способом иммунизируют целыми живыми и убитыми БЦЖ. Через 2 мес всех животных подвергают контрольному заражению вирулентными микобактериями туберкулеза и регистрируют падеж в экспериментальных группах в течение последующих 3 мес. Протективный эффект оценивают по средней продолжительности жизни. Как следует из табл,3 оболочки БЦЖ в дозе 0,1 мг на животное и оболочки N.Ьоvis в дозе 0,37 мг на животное индуцируют противотуберкулезную резистентность, не уступающую по средней продолжительности жизни иммунизации вакциной БЦИ в дозе

1 мг на животное при однотипном способе введения, в чем проявляется иммуногенность полученной по предлагаемому способу фракции оболочек микобактерий туберкулеза. Сама по себе масляно-водная эмульсия, целые живые и убитые БЦЖ в масляно-водной эмульсии не защищают животных от заражения туберкулезом. Оболочки M. bovis в дозе 0,03 мг на животное не обладают протективным эффектом.

338859

Формула изобретения

Способ получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза, включающий выращивание ми" кобактерий туберкулеза на питательной среде, сбор бакмассы микобакте-.рий, их механическую дезинтеграцию, осаждение неразрушенных микобактерий, концентрирование и очистку фракции клеточных оболочек с последующей лиофилизацией целевого продукта, о тл и.ч а ю шийся -тем, что, с целью повышения эффектности способа, сбор .бакмассы микобактерий осуществляют с помощью бус в физиологическом растворе с рН 7,0 — 7,2 в течение 60...90 мин при соотношении бакмасса: бусы: физиологический раствор

1:2:1 ... 1,2:2,2:1,3, осаждение не20 разрушенных микобактерий осуществляют трехкратным центрифугированием при

2000g в течение 15...20 мин, концентрирование проводят путем центрифугиpoBRHHH надосадочной KHpKocTH IIpH

15000g в течение 60...90 мин, а последующую очистку фракции клеточных оболочек проводят путем постоянного перемешивания осадка с 0,4...0,5Х-ным

30 раствором тритона Х-100, добавляемого в соотношении 1:40...1:50, и последующего отмывания корпускулярной фракции дистиллированной водой с двухкратным центрифугированием при

15000...16000g в"течение 20 мин.

1338859

Продолжение табл.2

4000 об/мин

60-90 мин

Скорость вращения 6ус

Время дезинтеграции

Таблица 3.

Средняя продолжительность жизни, дней

Иммуниз ация

Доза на животное, мг

Вакцина БЦЖ

82,4 + 13,40

Живые БЦЖ в масляно-водной эмульсии

73,8 + 5,31

Убитые нагреванием БЦЖ в масляно-водной эмульсии

66 6 i+ 3 49

Оболочки БЦЖ в масляноводной эмульсии

82,5 + +10,69

79,8 1 25,40

84,0.+ 14,70

То же

0,3

0,1

Оболочки M. bovis в масляно-водной эмульсии

0,37

83,5 и 15,92

80,2 + 15,93

63 3 16,46

58,7 + 3,49

То же

0,1

0,03

Масляно-водная эмульсия

Контроль (интактные. животные) 68,9 1 17,80

Составитель С. Светлышев

Техред It. Олейник Корректор М. Максимишинец

Редактор Н. Тупица

Тираж 594 Подписное

ВНИИ11И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

133035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д..4/5

Заказ 4159/4

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4