Способ определения активности лизоцима в биологических жидкостях

Способ определения активности лизоцима в биологических жидкостях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологии . Цель изобретения - повьшение чувствительности способа. Раствор агара смешивают с убитой микробной взвесью определенной оптическойплотности и выливают на пластину. Вырезают лунки на пластине и вносят в них исследуемый материал. После инкубации измеряют диаметры зон лизиса . Уровень лизоцима в опытных образцах рассчитывают по калибровочной кривой. 00 со со 4 4 СГ5

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.,SU„„1339446 А1 (58 4 G О1 N 33 48 С 12 N 9/36

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ д

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3893300/28-14 (22) 25.02.85 (46) 23.09.87. Бюл. ¹ 35 (71) Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) И.С.Старостина и Л.А.Гостева (53) 612.015(088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ЛИЗОЦКЧА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ. (57) Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения — повышение чувствительности способа. Раствор агара смешивают с убитой микробной вэвесью определенной оптической. плотности и выпивают на пластину.

Вырезают лунки на пластине и вносят в них исследуемый материал. После инкубации измеряют диаметры зон лизиса. Уровень лиэоцима в опытных образцах рассчитывают по калибровочной кривой.

1339446

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к способам определения активности ферментов> в частности лизоцима, в биологических жид— .) костях (кровь, моча), и может быть использовано в лабораторной практике и научных исследованиях.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа за счет ис- 10 пользования в качестве субстрата убитой, предварительно стандартизованной Micrococcus lysodeict icus.

Способ осуществляется следующим образом. 15

Готовят 1,3%-ный раствор агара на вероналмединаловом буфере с рН 8,6; фосфатный буфер с рН 6,2 для получения смывов с косячков и дальнейшего разведения полученной взвеси до опре- 2р деленного стандарта и убитую микробную взвесь Iicrococcus 1уsodåiс1з.савв: суточную культуру смывают с косячков 5-6 мл фосфатного буфера.

Полученную густую взвесь, предва- 26 рительно разлитую до 5 мл в пробирки, убивают автоклавированием при давлении в 1 атм в течение 15 мин, Мутность такой взвеси составляет обычно 1,6-1,8 ед. (до автокла1зирования более 2 ед. оптической плотности), Уровень мутности исходной |ззвеси определяют на ФЗК в кювете с расстоянием между рабочими гранями в 3 мм при длине волны 536 нм в пределах 0,71,2 ед. оптической плотности. Из концентрированной взвеси, которая при хранении в холодильнике сохраняет свои свойства два месяца, по мере надобности путем разведения готовит40 ся стандартная рабочая взвесь.

Опытным путем установлено что в реакции может быть использована взвесь с уровнем мутности 0,7-1,2 ед, оптической плотности.

При мутности ниже 0,7 и выше

1,2 ед, оптической плотности зоны лизиса получаются нечеткими. Наиболее оптимальная мутность 0,9-1,0 ед. оптической плотности. Убитая концентрированная взвесь может храниться в о холодильнике при 0-4 С, не теряя cBQ ей активности, до двух месяцев °

Ход определения: 5,5 мл расплавленного на водяной бане и охлажденноо го до 54 С раствора 37.-ного агара смешивают с 5,5 мл рабочей взвеси

Micrococcus lysodeicticu (оптическая плотность 0,9 ед.), согретой на водяной бане да 54"С, и смесь выливают ровным слоем на специальную стеклянную пластину размером 9х 12 см, установленную строго горизонтально, После застывания arapa пластину помещают на трафарет и пробойником вырезают лунки диаметром 3 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. На каждой пластине размещается 35 лунок, из которых в 25 вносятся с помощью микрошприца или откалиброванного капилляра Панченкова с оттянутым концом по

6 мл исследуемого материала, а в 10 лунок — стандартные растворы, используемые для построения калибровочной кривой с содержанием 100, 50, 25, 1?,5 мкг/мл кристаллического лизоцима. Пластины инкубируют во влажной камере (фотокювета, плотно прикрытая стеклом) при 37 С в течение

7 ч, По окончании инкубации измеряют диаметры зон лизиса. Измерение проводят при косом освещении на темном фоне при помощи штангенциркуля или чертежного измерителя, Уровень лизоцима в опытных образцах рассчитывают по калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметра зон лизиса от. концентрации лизоцима.

При этом на оси абсцисс откладывают диаметры зон лизиса, а на оси ординат — концентрацию лизоцима.

Измерив диаметр зон лизиса испытуе-.

МоН пробы, по вычерченному графику находят содержание в ней лизоцима в мкг/мл.

Пример 1. Обследован больной

П. с диагнозом геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (тяжелая форма). В остром периоде болезни активность лизоцима в сыворотке крови равнялась 110 мкг/мл, в периоде выздоравливания она уменьшалась до

47,5 мкг/мл.

Пример 2. Исследована сыворотка крови больного Р. с диагнозом дифиллоботриоз. Получено 51,0 мкг/мл лизоцима.

Всего обследовано 110 больных различными формами геморрагической лихорадки с почечным синдромом и 45 больных дифиллоботриозом. Предлагаемым способом обследовано также 140 здоровых. В норме среднее значение активности лизоцима равно 43,34" 0,66 мкг/мл. Зтим me методом определялась активность лизоцима в моче у

1339446

Составитель Н.Гуляева

Редактор И.1цулла Техред М.Ходанич Корректор М.Демчик

Заказ 4213/33 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 больных и доноров. В норме активность лизоцима в моче минимальна, Формула изобретения

Способ определения активности лизоцима в биологических жидкостях путем помещения исследуемой пробы и стандартного раствора лизоцима в лунки агарового геля, содержащего субстрат, полученный иэ Micrococcus

lysodeicticus, инкубации во влажной камере с последующим измерением диаметров зон радиального лизиса, отличающийся тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, в качестве субстрата используют убитую культуру Мхсгосoccus

lysodeicticus, концентрацию которой предварительно стандартиэируют на фотоэлектроколориметре.