Способ получения солей производных s-аденозилметионина

Способ получения солей производных s-аденозилметионина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается замещенных Сахаров, в частности солей производных S-аденознлметионина (AM) общей формулы j-S(CHj)-C Hjгде К - -СН.0-СН2 ,К;Н(КН2)-С(0)-ОК-А п НА; R-нор- - мальный шш изо-С -С -алкил; А - эквивалент кислоты с рКа 2,5;п - целое число 0-4, которые используют как биологически активные соединения, способные проходить через клеточные мембраны. Цель - создание более активных и стабильных соединений указанного класса. Синтез AM ведут из раствора соли 8-аденозш1метионина в соответствующем алкильном спирте, содержащем 1-3 об.% конц. H,SO, при кипячении. Затем ведут очистку полученного продукта пропусканием его через ионообменную смолу в { форме и элюированием водной кислотой. К злюату после концентрирования добавляют кислоту НА в количестве, необходимом для получения нужной соли ().Вьщеление последней ведут лиофильной сушкой. Испытания AM показь вают значительную противовоспалительную и анальгетическую активность , которые отсутствуют у известных аналогов. AM проявляют защитные и разрешающие действия при гепатитных стеатозах, вызванных алкогольным отравлением (глюцидный и протидный метаболизм). 5 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УЬЛИ К

09 (И) 3 „„13

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY вНЬННпТЕКА

Х, ; Х вЂ” -СН,-ЙСН,) -Сн,— где К н,ы (I

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕ ГЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3494860/23-04 (22) 10.09.82 (31) 23940-А/81 (32) 11.09.81 (33) IT (46) 23.09.87. Бюл. У 35 (71) Биорисерч С;п.А (IT) (72) Федерико Даеннари (IT) (53) 547.963.32.07(088.8) (56) Патент СССР У 576922, кл. С 07 С 149/247.

Патент СССР В 646915, кл. С 07 Н 19/169 1972.

Патент СССР з 676169, кл. С 07 Н 19/04, 1974.

Патент ФРГ Р 1803978, кл. С 07 H 19/16, опублик. 1968. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ ПРОИЗВОДНЫХ S-АДЕНОЗИЛИЕТИОНИНА (57) Изобретение касается замещенных сахаров, в частности солей производных S-аденоэилметионина (AN) общей формулы дц 4 С 07 Н 19/167 А 61 К 31/70

-СН -CH(NH )-C(0)-OR А и НА; R-нор-мальный RlIH Hso-С» -С -алкил; А — 3KBHвалент кислоты с рКа <2,5;и — целое число

0-4, которые используют как биологически активные соединения, способные проходить через клеточные мембраны.

Цель — создание более активных и стабильных соединений указанного класса.

Синтез АМ ведут из раствора соли

S-аденозилметионина в соответствующем алкильном спирте, содержащем 1-3 об.й конц. H SO, при кипячении. Затем ведут очистку полученного продукта пропусканием его через ионообменную смолу в деформе и элюированием водной кислотой. К элюату после концентрирования добавляют кислоту НА в количестве, необходимом для получения нужной соли

O (п=О-4) . Выделение последней ведут лиофильной сушкой. Испытания АМ показывают значительную противовоспалительную и анальгетическую активность, которые отсутствуют у известных аналогов. AN проявляют защитные и разрешающие действия при гепатитных стеатозах, вызванных алкогольным отравлением (глюцидный и протидный метаболизм). 5 табл.

1 ;340592

Изобретение относится к химии, бо- S-аденозилметнонин,< ($АМ) лее конкретно к способу получения но- мулы вых соединений — солей производных, г Гшей фОРNH

ji

+ сооя

— S — СН2СН2СН A-11 HA (I)

i 1

> сн, н, где К вЂ” линейный или разветвленный алкильный радикал с 1-6 атомами углерода, А — эквивалент кислоты с рКа (2,5;

n = 0-4.

Целью изобретения является получение новых биологически активных соединений, обладающих более высокой стабильностью и повышенной способностью проходить через клеточные мембраны.

Пример 1. Количество сульфата

SAM соответствующее 1 кг (2,732моль) ионов SAM, растворяют в 20 л метанола, содержащего 4,6 мас.Х концентрированной серной кислоты. Раствор кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч, охлаждают и разбавляют

20 л дистиллированной воды. Полученный раствор пропускают через колонку с Амберлитом-(RA-93, предварительно активированным 2 н. NaOH и промытым до рН 3, Используют 15 л смолы.

Элюат фильтруют и промывают дистиллированной водой. Метанол выпаривают в вакууме. Полученный раствор кипятят в течение 20 мин для удаления следов непрореагировавшего SAM, а затем охлаждают.

Подготавливают колонку с Амберлитом IRC-50 в Н -форме, содержащую

40 л смолы, активированной 100 л

0 5 н. Н SO, промытую до нейтральной реакции. Предварительно полученный раствор нейтрализуют до рН 6,5

2 н. NaOH, пропускают через колонку со скоростью 40 л/ч, затем промывают

40 л Н О.

Через колонку пропускают О, 1 н. раствор уксусной кислоты до рН 3 (около 200 л), а затем пропускают

40 л дистиллированной воды.

Проводят элюирование 60 л 0,1 н.

H

Для получения молярного отношения

15 метилового сложного эфира SAM и серной кислоты 1;2 добавляют достаточное количество концентрированной серной кислоты, а затем раствор лиофилизуют.

Получают 820 г метилового сложного эфира SAM 66,8% предлагаемой формулы (R — СН, Н $0+ 31,7%, Н О 1,5Х, что соответствует выходу 54,7Х.

При анализе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ко25 лонка Партисил-10 SCX муравьинокислый аммоний О, 1 М, рН 4, 20% метанол, скорость потока 1 мл/мин) продукт дает один пик с временем удерживания 580 с.

ЗО

Спектр УФ: рН 4, максимум поглощения при 258 нм — Е = 14040, рН 1, максимум поглощения нри 256 нм—

13500.

35 Спектр SIMP, м.д.: 3 (синглет -S —

-CH>-групп)„ 3,7 (синглет R-С-О-СН3О групп) .

Если перед лиофилизацией устанав40 ливают соотношение метилового сложного эфира SAM и серной кислоты 1:1 5 или 1:2,5 (молекулярное соотношение), а затем раствор лиофилизируют, получают соответственно соли — метиловый

45 сложный эфир SAM 1,5 Н2$0 <О 5 Н О, метиловый сложный эфир SAM 2,5 Н SO х х 0,5 Н О °

Если колонку IRC-50 элюируют вместо серной кислоты соляной, получают следующие соли: MBtHJIoBblH сложный эфир SAM>3HC1 0,5 Н О, метиловый сложный эфир $АМ 4НС1 ° 0,5 Н 0, метиловый сложный эфир БАМ 5НС1"0,5 Н О

Аналогичным образом, используя метансульфокислоту, получают соответствующие метансульфонаты.

Аналитические данные для этих солей приведены в табл . 1.

1340592

Пример 2. Повторяют процедуру, описанную в примере 1, за тем исключениемр что исходные соединения кипятят с обратным холодильником в течение 14 ч, используя абсолютный этанол, содержащий 4,6 мас.Х серной кислоты.

Этиловый сложный эфир ЯАМ получают в количестве 840 r в виде этилового сложного эфира SAM 2Н Я(0,5 Н О состава, Х: ЯАМ-этиловйй эфир (формула I, R - С Н ) 67,6; Н 80 31;

Н 01,4.

УФ-спектр: рН 4, максимум поглоще- 15 ния при 258 нм 6 14040; рН 1, максимум поглощения при 256 нм

13500.

Спектр ЯМР, м.д.: 1,25 (триплет, R-CH -групп); Э (синглет, S-СНн групп), 2р ,4,2 гввепруплет Н-С-0-СН -Н группы).

О

Выход 55Х.

При исследовании с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии 25 в условиях примера 1 продукт дает один пик со временем удерживания

600 с.

По методу, приведенному s npuueре 1, возможно получение целого ряда 3р солей: этиловый сложный эфир SAM x х 1.,5 Н SO у„0,5 Н О; этиловый сложный эфир SAM 2,5 Н SO 0,5 Н10, эти" ловый сложный эфир SAM 3 НС1н0,5 HgO, этиловый сложный эфир $АМ 4 НС1 2р .24 0,5 н О; этиловый сложный эфир

$АМ 5 НС1 0,5 Н10; этиловый сложный эфир $АМ ЭСН ЯОнН ° 0,5 Н Оер этиловый сложный эфир SAM 4 СНзЯО Н 0,5 Н О; этиловый сложный эфир ВАМн5СНЗЯОн Н х 4р х 0,5 Н О.

Спектры УФ и ЯМР всех этих солей

:идентичны спектрам приведенных ранее солей.

Пример 3. Повторяют процеду- 45 ру, описанную в примере 1, используя н-бутанол, содержащий 4,6 мас.Х серной кислоты и нагревая исходную смесь с обратным холодильником в течение

10 ч. 50

Вначале получают суспенэию, которая превращается в прозрачный раствор после кипячения с обратным холодильником 05

ПолуЧают смесь сложного н-бутилового эфира SAM следующей формулы: н-бутиловый .сложный эфир ВАМ 2 Н SO x х 0,5 Н00.

УФ-спектр: рН 4, максимум поглощения при 258 нм Е 14,040; рН 1, максимум поглощения при 256 нм

13,500.

Спектр ЯМР, м.д.: 0,9 (триплет, характерный для R-CH) -группы); Э (синглет, характерный для Я-СН -группы);

4, 1 (квадруплет, характерный для

R-С-0-СН -R-группы).

0 2

При анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 продукт дает один пик са временем удерживания 650 с.

В описанных условиях получают се" рию солей, аналогичных приведенным в примерах 1 и 2.

Используя н-пентанол и н-гексанол вместо бутанола получают н-пентильные и н-гексильные сложные эфиры.

В табл. 2 даны аналитические данные для сложных эфиров .ЯАМ, полученных в примерах 2 и 3.

Пример 4. Количество сульфата

SAM, эквивалентное 1 кг ионов $АМ, растворяют в 20 л изопропилового спирта, содержащего 2Х (по объему) концентрированной серной кислоты. Раствор нагревают в течение 16 ч. Полученную реакционную смесь обрабатывают смолой Амберлит, как в примере 1. Получают изопропиловый эфир ЯАМ 2Н 80 х х 0,5 НнО 855 г, состав, Х: изолропиловый сложный эфир SAM, 68; серная кислота 30; 55; вода 1,45.

Пример 5. Количество сульфата

ЯАМ, соответствующее 1 кг ионов ЯАМ, растворяют в 20 л изобутилового спирта, содержащего 2Х (по объему) кон" центрированной серной кислоты. Раствор кипятят с обратным холодильником

16 ч. Полученную реакционную смесь обрабатывают смолой Амберлит как в примере 1. Получают изобутиловый сложный эфир $АМ 2 Н ЯО ° 0,5 Н О .

860 г, состав, Х: иэобутиловый эфир

ЯАМ, 68,5, серная кислота 30, 1; вода 1,4.

Стабильность полученных солей эфи. ров производных $"аденоэилметионина сравнивают со стабильностью соли 8аденозилметионина.

В табл. 3 приведена стабильность водных растворов солей эфиров SAM (n 3) при различных рН. рН водных растворов устанавливают добавлением определенного количества

134

Na 00>. Полученные результаты демонстрируют более высокую стабильность солей эфиров SAM по сравнению с SAM.

Способность солей эфиров БАМ проходить через клеточные барьеры характеризуется данными, приведенными в табл. 4.

В опыте "in situ" (кишечные мешочки) 2 мг каждого испытуемого продукта в 1 мл физиологического раствора помещают в кишечные мешочки крысам под эфирной анестезией, Крысы погибают через 2 ч, и остаточное содержание мешочка (стенка + содержание) анализируют. Определенное таким образом количество мигрировавшего продукта приводится в табл. 4 (7) от исходного количества в мешочке °

В других опытах используют кусочки вывернутой кишки, которые выдерживают при 37 С (по методу Кребса-Риндера) в растворе с внешней концентрацией исследуемого соединения 10 М.

Количество абсорбированного продукта, подтвержденное анализом, приводится в табл. 4 в виде удельной величины, т.е. моль/ч/мг ткани. Соли всех соединений получают с одинаковым количеством Н SO .

Соединения (I) хорошо поглощаются в кишечном тракте, причем более интенсивно, чем сульфат SAM что позволяет достигать в плазме при оральном применении значйтельно более высоких концентраций действующего вещества, чем при использовании сульфата SAM.

Токсичность. Острую токсичность определяют на мышах. Во всех случаях получают следующие значения: ЛД при оральном лечении более 3 г/кг, ЛД при внутривенном введении более 1 кг.

0592

При внутриненном введении доз вплоть до 200 мг/кг у кроликов не обнаруживалось пирогенных явлений.

При внутривенном введении кроликам и крысам 40 мг/кг не наблюдалось изменений в каротидном давлении, частоте сердечных и дыхательных сокращений или на электрокардиограмме.

Локальная переносимость внутримышечных инъекций даже после повторения вве) ений в течение 30-60 дней и внутривенных инъекций в маргинальную вену наружного уха кроликов была превосходнои.

Фармакология. Полная серия тестов, проведенных на крысах, продемонстрировала,. что соединения (I) обладают весьма заметными защитными и разрешающими действиями при гепатитных стеатозах, вызванных гиперлипид-гипербелковой диетой по способу Хандлера, и при стеатозах, вызванных острыми ацкогольными отравлениями и другими токсическими агентами, при приеме в дозах 10 мг/кг SAM

При экспериментальной гиперлипемии у крыс, например, вызванной Tritons соединения (I) продемонстрировали

30 черезвычайно заметную гиполипемическую активность, которая в дозах 10 мг/кг (ионов SAM ) значительно превосходила другие препараты с гиполипемической активностью.

У цыплят с атеросклерозом, вызван35 ным с помощью диеты, обогащенной холестерином и фруктозой, при парэнтеральном введении соединений (I) в дозах 10 мг/кг снижалась холестероле4 мия и благоприятно модифицировались повреждения по сравнению с контроль.ными экземплярами по отношению к торакальной и абдоминальной аорте и мелким сосудам энцефалической основы.

Тесты на переносимость и хроническую токсичность проводят на крысах штамма Wistar u Sprague — Dowley, вводя им 20 мг/кг в день исследуемого соединения в течение 12 мес. По окончании обработки в различных органах 5О и системах не обнаружено патологических отклонений.

На кроликах проводят тесты тератогенезиса. При введении доз солей, в

10 раз превышающих терапевтическую максимальную дозу, не наблюдалось тератогенического действия или злокачественных новообразований на зародышах или выросших плодах.

Что касается фосфолипидного метаболизма, экспериментально было обнаружено, что имеется увеличение фосфатидилхолина в генатитной ткани крыс при некомпенсированных стеатоэах.

Четкое повышение фосфатидилхолина было также определено в опытах гематических Ы-липопротеинов в экспериментальных альтерациях, вызванных

p/Û-липопротеиновыми отношениями, Во всех этих тестах имеются четкие указания на лечебное действие соединений (I) при нарушениях липидного метаболизма.

Следующую серию тестов проводили на крысах, и она продемонстрировала, что введение доз 1 мг/кг вызывает аккумуляцию гликогенных резервов на

5 гепатитном и мускульном уровнях, что демонстрируется, как гистохимическими методами, так и количественными измерениями. В экспериментальных диабетах, вызванных аллоксаном, количест- 10 во инсулина, необходимого для возвращения гликемических значений к нормальным, значительно снижалось при введении 0,5 мг/кг БАМ+.

Эта серия экспериментов продемонстрировала отчетливое положительное действие соединения (?) на глюцидный метаболизм.

Крыс с экспериментально вызванной гиподиспротеинемией обрабатывали производными БАМ в дозе 10 мг/кг. Обнаружено, что указанные продукты возвращают полные протеинемичные значения к нормальным при существенном повьппении уровня альбумина и тем самым 25 демонстрируют заметную протеиновую анаболическую активность.

Эти и другие аналогичные тесты

;продемонстрировали лечебную эффективСНЗ . CQOR

2 S — СН2СН2СН А-ПЦ,4„

ЗН

2 обратным холодильником, полученный продукт очищают пропусканием реакционной смеси через колонку с ионооб4р ной смолой в Н -форме, элюируя pasбавленным водным раствором кислоты

НА, а к элюату после концтрирования добавляют кислоту НА в количестве, необходимом для достижения заданной

45 величины и полученную соль производФ ного S-аденозилметионина выцеляют лиофильной сушкой. где R — линейный или разветвленный

С -С -алкил

1 Э

А — эквивалент кислоты с рКа ( а2,5; п=0-4, отличающийся тем, что,. раствор соли S-аденозилметионина в соответствующем спирте ROH, где R —улкильный радикал, определенный выше, содержащем 1-3Х концентрированной серной кислоты по объему, кипятят с

92

8 ность соединений (Z) при нарушениях протидного .метаболизма.

Соединения (Z) обладают также значительной противовоспалительной и анальгетической активностью по сравнению с известными.

Испытания противовоспалительной и анальгетической активности соединений (I) проводились по методу Уинтера путем оценки их воздействия на edema, вызванную каррагенином у крыс, и реакции на ожог у мышей на горячей пластинке (метод Янссена и Ячено) .

Сульфат БАМ при оральном применении не обладал какой-либо противовоспалительной и болеутолящей активностью. Кроме того, противовоспалительная и болеутоляющая активность соединений (?) вьппе, чем соответствующая активность сульфата БАМ при внутримьппечном применении.

Формула и з обре т е н и я

Способ получения солей производных

S-аденозилметионина общей формулы

1340592

Таблица1

Е* (1X 1 см Выход, Н 4) 7.

Соль $АМ Е вЂ” СН

XS

Вычис- Найдено лено

Найдено

Вычис лено

247

54,7

228 .

54,7

16,82 16, 72

54,7

211

6,04 6,01

15, 79

55,6

265

14,87

5,64 5,65

248

55,6

13,95 5,31 5, 29 233

55,6

198

54,3

10 48 10 49 19 88 19 86

174

54,3

54,3

9,32 9,29 21,31 21,35

156

"Поглощакщая способность 1Х-ного водного раствора соединения (I) толщиной 1 см при рН 4 в УФ-свете.

Таблица2

Соединение формулы (Х) Количество N,X Количество S, М

Вычислено

Найде но

Вычис- Найдено лево

15, 18 222 49,5

14,85 217 46, 3

Метиловый сложный эфир 1,5 Н 80 х х 0,5 НtO 14,79 14,78 14,08 14,01

Метиловый сложный эфир 2 Н 80 х х 0,5 Н О 13,61 13,73 15,56, 15,61

Метиловый сложный эфир 2,5 Н 80 х х 0,5 Н О 12 61 12 59

Метиловый сложный эфир 3 НС1: 0,5 НО 15,85

Метиловый сложный эфир 4 НС1 0,5Н О 14,81

Метиловый сложный эфир 5НС10,5 Н 0 13,93

Меткповый сложный эфир 3 СН SO х х 0,5 Н О 11,85 11,87 18,05 17,99

Метиловый сложный эфир 4 СН 80"Н х х 0,5 Н О

Метиловый сложный эфир 5,СН $0 х х 0,5 Н О

8АМ этиловый сложный эфир 2Н $0 0,5 Н О 13,29 13,27 15,19

SAM н-пропиловый сложный эфир 2Н 80 х х05НО 13,00 13,02 14,86

E (1X, Выход, X

Ф см рН 4) 12

1340 >9;!

Продолжение табл.2

Выход, Соединение формулы (I) Количество S, Х

Количество N,7

Найдено

12,73 12,71 14,55 14,52 213 41,1

SAM H-пентиловый ный эфир 2Н SO x х 0,5 Н О 12,46 12,45 14„ 24 14,25 208 38,4

SAM н-гексиловый сложный эфир 2Н $0„х х0,5НО 12,21 12,23 13,95 13,93 204 35,3

Таблица3

R pH раст- Темперавора тура, С

Разложение, Ж, через, мин

30 60 240

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

II

100

10

CH

100

100

100 снэ

100

100

С,Н, 35

100

55

100

СуН

80

100

С Н, 30

100

С Н

12

100

75

SAM н-бутиловый сложныи эфир 2Н SO x х 0,5 Н О

Вычис- Н айде но лено

Вычислено

F, (iZ, 1 см рН= 4) 14

1340592

Таблица 4

R Поглощение Адсорбция продукта дозы в ме- в вывернутой кишке, шочке, Х моль/ч/MI ткани

0,009

0,078

0,061

59 сн сунт

65 с,и, 68 с н„, сн, 67

Таблица5

Испытуемый продукт

Метод применения

Противовоспалительная акБолеутоляющая активность. оза, r/êã тивность

100 Оральный

49 с,н

100

45

109

50 сн

47

100

43

100

40 сн

100

46

100

1О

100 Внутримышечный

20

ВНИИПК Заказ 4356/59 Тирвк 347 Подпис ное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Уагород, ул. Проектная, 4

С Н )-изо

С Н,-изо

С И -изо с н, 8АИ 2,5 Í SO

8АИ 2,5 Н SO .

0,045

0,037

0,025

0,023

Предохранение от вызванной каррагенином

edema через 4 ч

Защита в пересчете на увеличение времени реакции на оког через 1 ч после при" менения, Х