Способ получения производных хлоргидрата гептапептида

Способ получения производных хлоргидрата гептапептида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается производных пептидов, в частности хлоргидратов гептапептидов H Val-Pro-Pro-Leu-Gly- Trp-Met-Y-HCl, гдеТ-ОН, OCHj, которые обладают биологической активностью и могут найти применение в ветерина- .рии. Цель изобретения - создание более активных соединений указанного класса. Их синтез ведут из активированного этилхлорформиатом пептида Boc-Val-Pro-Pro-OH, и метилового эфира тетрапептида H-Leu-Gly-Trp-Met-OCH х к НС 1 в среде тетрагидрофурана в присутствии N-метилморфолина при (-12) С в течение 1ч, а затем при О - (+15)°С в течение 2 ч. Полученный продукт Boc-Val-Pro-Pro-Leu-Cly-Trp-Met- OCHj, в случае необходимости, оныляют едким натром в метаноле и защищенный пептид деблокируют обработкой хлористым водородом в присутствии анизола и 2-меркаптоэтанола. Испытания новых пептидов показьшают, что они малотоксичны и обладают более высокой способностью промотировать рост животных , чем известньй тетрапептид Туг- Pvo-Trp-Met-NH. 2 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ!УБЛИК

ЗСРСОНЛМАЯ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ!

3.; .,13

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3843335/23-04 (22) 28.11 ° 84 (46) 30.09.87. Бюл.¹ 36 (71) Фармиталиа Карло Эрба С.п.A. (1Т) (72) Роберто де Кастилионе, Джузеппе

Персео, Мауро Джигли (!Т) и Барбара

Хехт (DE) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Патент Великобритании

2130590, кл. C 07 С 103/52, опублик. 06.01.84.

Шредер Э., Любке К. Пептиды. M.:

Мир, 1967, ч. I, с.116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

ХЛОРГИДРАТА ГЕПТАПЕПТИДА (57) Изобретение касается производных пептидов, в частности хлоргидратов гептапептидов Н-Val-Pro-Pro-Leu-GlyTrp-Net-Y-НС1, гдеY-ОН, ОСН, которые обладают биологической активностью

SU„„1342424 а 3 (5D 4 С 07 К 7/06// А 23 К 1/16 и могут найти применение в ветеринарии, Цель изобретения — создание более активных соединений указанного класса. Их синтез ведут из активированного этилхлорформиатом пептида

Вос-Val-Pro-Pro-0H, иметилового эфира тетрапептида Н-Leu-Gly-Тгр-Met-ОСН>x

« НС! в среде тетрагидрофурана в прио сутствии N-метилморфолина при (-!2) С в течение 1 ч, а затем при 0— (+15) С в течение 2 ч. Полученный продукт Вос-Val-Pro-Pro-Leu-Cly-Trp-NetOCH> в случае необходимости, омыляют едким натром в метаноле и защищенный пептид деблокируют обработкой хлористым водородом в присутствии анизола и 2-меркаптоэтанола. Испытания новых пептидов показывают, что они малотоксичны и обладают более высокой способностью промотировать рост животных, чем известный тетрапептид TyrPvo-Trp-Met-ЙН . 2 табл.

39, 00 г (86, 75 ммоль) BOC-Trp- Met0Me (I) растворяют в 390 мл муравьиной кислоты при комнатной температуре. После завершения удаления ВОС (контролируемого TLC) растворитель о выпаривают в вакууме при 30 С. Остаток растворяют в метаноле, охлажденном до 0 С, и добавляют 34,7 мл (104,1 ммоль) ЗМ раствора НС1/ТГФ.

Растворители удаляют в вакууме и получают 33,48 г в количественном выходе соединения П в виде масла, Кй 0,71; Е „ Oэ82 °

Стадия 3. ВОС-Gly-Trp-Met-OMe (П!).

134242

Изобретение относится к способу получения производных хлоргидрата гексапептида — новых биологически активных соединений, которые могут .) найти применение в ветеринарии.

Целью изобретения являются новые производные гексапептидов, малотоксичные, обладающие высокой способностью промотировать рост животных. 10.

Значения R определяют с помощью предварительно обработанных пластин силикагеля 60 Г (Мегск) толщиной слоя 0,25 мм, длиной 20 см, используя следующие проявляющие системы, Система А. Бензол/бензин (60-80 ) этилацетат = 70(10 )40 по объему, Система В. Бензол/этилацетат (уксусная кислота ) вода =

= 100(100/20)10 по объему (верхняя фаза) .

Система С, Бензол/этилацетат (уксусная кислота ) вода = — 100(100/40)15 по объе- 2В му (верхняя фаза ).

Система D. н-бутанол (уксусная кислота ) вода = 4 (1) 1 по объему.

"Е.Магск" — торговая марка.

Анализы тонкослойной жидкостной 30 хроматографии осуществляют в интервале температур 18-25 С, при этом значения R< могли изменяться íà +5X.

Температуры плавления определяют в открытых капиллярах в.аппарате Тото35 ли и поправку не вносят. Большинство производных размягчается и разлагается перед плавлением. Растворители для кристаллизации, осаждения или измельчения указаны в скобках. 40

Высоковольтный бумажный электрофорез проводят на приборе Phet ographOriginal-Frankfurt тип 64 на бумаге

Schleicher and Schull Р 2317 при рН 1,2 (муравьиная кислота:уксусная кислота:вода = 123:100:777 по объему), при 1600v/40v (см) при рН 5,8 (пиридин:уксусная кислота:вода =

450:50:45000 по объему) при 1400ч/

/32,5v (см). Полученные продукты характеризуют по их подвижностям по отношению к G1U при рН 1,2 (Е, и рН 5э8 (E>z) °

В примерах использованы следующие символы и сокращения: АсОЕ этилацетат; ВОС трет-бутоксикарбонил;

Bzl бензил, — разложение; ДМФ диметилформамид; Et О диэтиловый эфир;

НС1 (ТГФ хлористый водород в тетра4 2 гидрофуране), i = Pr O диизопропиловый эфир; i = PrOH изопропанол; Ме метил; МеОН метанол; NMM. N-метил-морфолин; PE петролейный эфир; ТГФ тетрагидрофуран; TLC тонкослойная хроматография.

Пример 1. Получение Н-ValPro-Pro-Leu-G1y-Trp Met-OÍ, НС1 (XIII ТК-7). Стадия 1. ВОС-Trp-MetOMe (Х).

К раствору 30,43 г (100 ммоль)

BOC-Trp-0Í в 200 мл безводного ТГФ последовательно добавляют 11,2 мл (100 ммоль) NMM и 9,9 мл этилхлоро формата при -12 С. После перемешивания при этой температуре в течение

2 мин добавляют холодный раствор

19,96 r (100 ммоль) НС1 Н-Met-OMe u

11,2 мл NMM (100 ммоль) в 150 мл

ДМФ. Реакционную смесь перемешивают о в течение 45 мин при -12 С и 90 мин о при 0-15 С, а затем фильтруют от солей и выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и промывают несколько раз последовательно хлористым натрием насыщенными растворами

1М лимонной кислоты, 1М бикарбоната натрия и водой. Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют в вакууме.

Получают 39,12 r (выход 877) соединения I из изо-PrOH (изо-Pr 0)РЕ:т. пл. 95-97 С. (Мв = -25,1 (с — 1, MeOH). R<„0,73; R 0,76.

Стадия 2. НС1 Й-Trp-Met-ОМе (II ) .

Исходя из 15,20 г (86,75 ммоль)

BOC-Cly-0Í и 33,48 г (86,75 ммоль )

НС1 H-Trp-Met-ONe (П) по способу ста. дии I используя хлороформ вместо этилацетата при выделении продукта, получают 26,37 r (выход 607 ) соединения Ш из ACOEt (E O ) изо-PrgO:

134242

:т.пл. 140-145 С ° (ь. " = -30 С х х (с = 1, MeOH) . R 0,56; R 0,77;

R1 0,27, Стадия 4. НС1 Н-Gly-Trp-Met-OMe (1V ).

Исходя из 26,20 г (51,71 ммоль)

ВОС-Gly-Trp-Met-ONe (Ш) и по способу, описанному на стадии 2, получают

21,76 г (выход 95% ) соединения Р из изо — PrOH/èçî-Pr О:т.пл. 195 С (с разложением ), (+20 = — 12,9 (с = 1, МеОН), Р 0,49; Е, 0,84.

Стадия 5. ВОС-Leu-Gly-Тгр-Меt-ОМе (Ч).

К раствору 12,16 r (48,76 ммоль)

ВОС-Leu-OH в 120 мл безводного ТГФ последовательно добавляют 5,5 мл (48,76 моль) NMN и 4,8 мл (48,76 ммоль ) этилхлорформата при — 12 С. После перемешивания в течение

2 мин при этой температуре добавляют охлажденный раствор 21,6 г (48, 76 ммоль ) НС1 Н-Gly-Trp-Net — OMe (1Ч ) и 5,5 мл (48,76 ммоль ) NNN в 2Б

100 мл ДМФ. Реакционную смесь перео мешивают в течение 1 ч при — 12 С и в течение 2 ч при 0-15 С, а затем ото фильтровывают от солей и выпаривают в вакууме. Сырой продукт очищают на 30 хроматографической колонке на силикагеле (Мегск) О, 040 — О, 063 мм, элюируя АсОЕ. Соединение Ч получают из

AcOEt (Et 0)PE 18, 13 r (выход 60% ):

:т.пл. 110 С, (о ), = -31 6 (с =

1, MeOH ), R „0,14> Р ь 0,54.

Стадия 6. НС1.Н-Leu-Gly-Тгр-Met-ONe (VI).

18 г (29,04 ммоль ) ВОС-Leu-Gly- 4О

Тгр-Met-ONe (Ч ) растворяют в 290 мл насыщенного раствора хлористого водорода в ледяной уксусной кислоте, к которой добавлено 18 мл анизола и

9 мп. 2-меркаптоэтанола. Спустя 4>

30 мин при комнатной температуре.удаление ВОС завершается и растворитель удаляют в вакууме при 30 С. Сырой продукт очищают на хроматографической колонке на силикагеле (Merck )

0,040-0,063 мм, элюируя смесью хлороформ:метанол = 8:2. Из изо-РгОН/изоPr O получают 12,44 г (выход 77% ) соединения VI : т. пл, 170 С. (l в = — 9,9 (с = 1, MeOH ) RI 0,62;

Е,, 0,71.

Стадия 7. ВОС-Pro †P-OBzl (VII).

К раствору 21,52 r (100 ммоль )

BOG-Pro-ОН в 200 мл безводного ТГФ

4 последовательно добавляют 11,2 мл

ММ1 и 13 3 мл изобутилхлорформата при

0 — 10 С. После перемешивания в течение

3 мин при этой температуре добавляют холодный раствор 24,17 r (100 ммоль ).

НС1 Н-Pro-OBzl и 11,2 мл (100 ммоль )

NMM в 150 мл ДМФ. Реакционную смесь о перемешивают в течение 1 ч при — 10 С о и в течение 2 ч при 0-15 С, а затем фильтруют от солей и выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и несколько раз промывают насыщенными растворами хлористого натрия

1М лимонной кислоты, 1М бикарбоната натрия и воды. Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют в вакууме, после чегополучают 34,21г (выход 85%) соединения VIIв видемасла R 0,62.

Стадия 8. НС1 Н-Pro-Pro-OBzl (VIII).

34,21 r (85 ммоль) ВОС-Pro-ProOBzl (VIi) растворяют в 342 мл насыщенного раствора хлористого водорода в уксусной кислоте при комнатной температуре. Спустя 30 мин удаление BOG завершается и растворитель удаляют в вакууме, Из изо-PrOH/AcOE1 получают 21,60 r (выход 75% ) соединения

Р р 0,32; Е (,, 1,)2.

Стадия 9. ВОС-Val-Pro-Pro-OBzl (Ix).

Исходя из 13,79 г (63,45 ммоль )

ВОС-Val-OH и 21,5 г (63,45 ммоль)

НС1 Н-Pro-Pro-OBzl (VIu) и по способу стадии 7 получают 22,28 г (выход 70% ) соединения IX в виде масла после очистки на хро мато rp афиче ской колонке с силикагелем (Merck) 0,040-0,063 мм, элюируя сме сью э тил аце тат: метанол =

= 98:2.

Стадия 10. ВОС вЂ” Val-Pro-Pro-OH (Х).

22,28 r (44,42 ммоль ) ВОС-Ча1Рго-Pro-OBzl (IX) растворяют в 150 мл метанола и гидрируют при комнатной температуре и атмосферном давлении в присутствии 4,46 .r (10% ) по весу палладия на угле. Катализатор удаляют фильтрованием, а раствор концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и концентрируют в вакууме.

После разбавления диэтиловым эфиром получают 10,98 г (выход 60% ) соединения X т.пл. 184-199 С. (о ) — 149,9 (с = 1, MeOH), R< 0 24;

R< 0,53; Е з,s 0,51.

Стадия 11. ВОС-Yal-Pro-Pro-Leu-GlyTrp-Net-ONe (Х1 ).

Исходя из 9,10 г (22,12 ммоль)

BOG-Val-Pro-Pro-OH и 12,30 г

5 134 (22,12 ммоль) НС1 Н-Leu-Gly-Trp-Met0Me (YI ) и по способу стадии 5, однако используя в качестве элюента этилацетат, содержащий возрастающие количества метанола от 5 до ЗОЖ в процессе хроматографической очистки, получают 16,16 г (выход 80X ) соединения XI из изо-РгОН/изо-Pr О:". т.пл. 184-190 С. (oL) „ = -98,9 (с = 1, MeOH) RI 0,13; К О 58.

Стадия 12. ВОС-Yal-Pro-Pro-Leu-Gly-.

Trp-Met-0H (Хи ).

5,00 г (5,48 ммоль ) ВОС-Yal-ProPro-Leu-Gly-Trp-Met-0Me (XI) растворяют в 20 мл метанола и омыляют 10 мл

1М гидроокиси натрия в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор разбавляют водой, частично концентрируют в вакууме, охлаждают до О С, подкисляют до рН 25 M водной соляной кислотой, а затем несколько раз экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают до нейтрального насыщенным водным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. После удаления растворителя получают 3,99 г (выход 8IX ) соединения Xii: т.пл. 194-200 С. (ва) = -102,9 С (с = 1, MeOH)

1с 0,34; Eg,g 0,18 Glu.

Стадия 13. Н- Yal-Pro-Pro-Leu-GlyTrp-Me t -0H . НС1 (X III ).

Исходя из 3,85 r (4,28 ммоль)

ВОС-Y a l-Pro-Р ro-Leu-Gly-Тгр-Me t-OH (XII) и по способу стадии б получают

3,05 r сырого соединения XIII из изоPr0H/изо-Pr О. Затем этот продукт очищают на ДЕАЕ -Scphadex А-25 (торговая марка ), используя в качестве элюента 0,02 М раствор ацетата аммония при рН 6,7. После лиофилизации из уксусной кислоты продукт вновь растворяют в уксусной кислоте и обрабатывают 6 мл насыщенного раствора соляной кислоты в уксусной кислоте.

Раствор выливают в диэтиловый эфир.

Получают 2,57 г (выход 727 ) соединения Xiii: т. пл. 150 С. (К)

= -90,5 (с = 1, ИеОН); R< 0,30; г 0,58

Пример 2. Получение НС HVal-Pro-Prî-Кеи-С1у-Trp-Met"ОМе (XIV)ТК7. Исходя из 5,00 r (4,28 ммоль) ВОС-Yal-Pro-pro-1 ец-G)yTrp-Met-0Ìå (XI ), полученного в примере 1, стадия 11, и по способу примера 1 стадии 6 однако, используя

2424 в качестве элюента систему CH C8

:МеОН:Н 0 = 86; 14: 1 во время хроматографической очистки, получают

2,73 r (выход 757,) соединения XIY из

АсОЕ : т.пл. 154 С; (0L) --- -92,4 С (с = 1, МеОН," RI О 34; Е, 0 58 Glu.

Пример 3. Получение НС1 НЧа1-Pro-Pro-Leu-Gly-Тгр-Меl-NH (ХЧ ) .

5,00 г (4,28 ммоль) ВОС-Val-ProPro-Leu-Gly-Trp-Met-0Me (Х1 ), полученного в примере 1 на стадии 11, растворяют в растворе 100 мл метанола и 2 мл этиленгликоля, и насыщают о аммиаком при О С. Реакционную смесь выдерживают в холодильнике в течение

3 дней, а затем избыток аммиака и растворитель удаляют в вакууме. Неочищенный продукт частично очищают на хроматографической колонке с силикагелем (Мегск) 0,040-0,063 мм, элюируя смесью АсОЕ:МеОН = 87:13 и используя на следующей стадии без очистки (получают 2,58 г соединения

IX и изо-РгОН/изо-Pr 0):R< 0,31, Стадия 2. Н-Yal-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp—

Met-ИН НС1,XVI;. ! цов крыс (Wi star, Hagemann, Extertal), разделенные на подгруппы по

3 животных, которых содержали в клетЗ0 Исходя из 2 45 г (2 73 ммоль)

В0С-)1al-Ðrо-Pro †L-Gly — Trp-Met-NH (XY) и по способу примера 1 стадии 6, однако, используя в качестве элюентов системы СН Сl :Ме-ОН:Н О = 85:

:15:1 по объему и СН Сl :MeOH:Í О =

80:20:1 по объему при хроматографической очистке, получают 1,55 r (выход 68Х) соединения ХЧ1 из МеОН (изо-РгОН)изо-Fr<0 после удаления

40 солей íà Sephadex GIO (торговая марка): т.пл. 150-158 С. (K) z

= -74,8 (с = 1, МеОН) R 0,36;

Е< 0,55 Glu. Проведены бйологические испытания описываемых гептапепти45 дов. Описываемые гептапептиды демонстрируют интересную активность промотирования роста животных, определенную в тестовых системах in vivo—

in vitro no синтезу протеина тканью печени и по зависящим от дозы привесу и эффективности корма после подкожного и орального введения.

Тест по синтезу протеина in vivo

in vitro.

Тест по росту проводили в течение

4 недель, используя группы по 6 самЕжедневные инъекции физиологического солевого раствора вызывают сничп жение привеса по сравнению с необработанными животными. Несмотря на такое снижение привеса, вызванное стрессом при инъекциях, те животные, которым ежедневно вводили ТК-7, дали отчетливый привес. Эффективность усвоения пищи отражает результаты привеса.

Формула изобретения

Способ получения производных хлоргидрата гептапептида формулы где Y — ОН, OCH отличающийся

45 трипеп™д формулы тем, что

7 13424 ках Макролона с древесными опилками в качестве подстилки. Вода и корм (стандартный рацион А11гоп«1п 1321, содержащий 19Х неочищенного протеина):ad Libit«un.

Пептиды общей формулы вводили в растворе подкожно ежедневно в дозах

10,50 и 100 нг/кг, используя в качестве разбавителя нормальный физиологический раствор (исходя из начального раствора 100 нг/мл).

Получение образцов тканей. Гомогенизируют 3 г печени в 9 мл буферного сахарозного раствора ТКМ, охлажденного на льду в гомогенизаторе Поттера со скоростью 600 об/мин в течение о

2 мин, центрифугируют при 4 С в ультрацентрифуге при 10000g в течение

20 мин, декантируют надосадочную жидкость = сок микросомных клеток.

Рабочая процедура. После подсчета содержания протеина в соке микросомных клеток с помощью биуретического метода, концентрацию протеина дОводят 25 с помощью ТКМ буфера до 1 мг/мл.

После этого проводят разбавление бидистиллированной водой до 0,25 мг протеина на мл сока микросомных клеток.

Добавляют последовательные порции

0,15 мл реакционной среды и 0,05 мл (50 мкг) раствора пируваткиназы, а также 0,1 мл « С смеси аминокислот (= 1 мк Кюри). Получают объемы по

1 мл инкубируемой смеси.

После инкубирования в течение

35 мин при 37 С в водяной бане получают осалщение протеина за счет добавления 2 мл трихлоруксусной кислоты (107). Осадок промывают, добавляя несколько раз трихлоруксусную кислоту, затем центрифугируют (3600 г/мин) до тех пор, пока в надосадочной жидкости не остается следов радиоактивности, Остаток растворяют в 1,0 мл Lumasolve и оставляют в течение ночи при о

37 С до тех пор, пока он не становится прозрачным. Изменения проводят на

PRIAS жидкостном сцинтилляционном счетчике PL (1 0 + 5 мл сцинтилляционной жидкости).

Результаты измерений скорости синтеза белка в тканях печени мужских 55 особей крыс после обработки в течение 4 недель и данные по токсичности (ежедневные подкожные инъекции) приведены в табл.1.

24 8

Контрольная группа. У тех крыс,которым подкожно вводили физиологический соленой раствор по сравнению с необработанной контрольной группой, наблюдалось снижение активности синтеза протеина порядка 13,61. Предлагаемые гептапептиды значительно ускоряют скорость синтеза белка в печени крыс. При введении их крысам в дозе

10 нг/кг скорость синтеза белка

29,4 и 36,IX в то время как известное соединение ускоряет синтез белка на 17,3Х.

Тест по росту свиней. Тест по привесу проводили в течение 4 недель, используя группы из 7 кастрированных самцов свиней (Грибриды), разделенных на подгруппы и содержащиеся в загонах с плоскими настилами. Свиньям в течение всего эксперимента давали корм в количестве 1 кг в день (Hoveler, нормального типа, без добавок), воду в неограниченном количестве. Привес учитывали ежедневно ° Результаты эксперимента приведены в табл.2.

Н-Val-Pro-Pro -Leu-Gló-Trp-Met-Y НС1, Вос-Val-Pro-Pro ОН, активированный этилхлорформиатом, вводят во взаимодействие с метиловым эфиром хлоргидрата тетрапептида формулы

Leu-G1y-Trp-Met ОСН НС1 в тетрагидрофуране в присутствии Nметилморфолина при -12 С в течение

1 ч, а затем при 0-15 С в течение

2 ч и полученный продукт. формулы

Вос-Val-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp-Met ОСН

9 1342424

10 в случае необходимости омыляют обра- кой хлористым водородом в приботкой едким натром в метаноле и де- сутствии анизола и 2 — меркапблокируют защищенный пептид обработ- тоэтанола.

Таблица 1

Д,Й

Контрольная необработанная

Группа крыс обработанная

Подострая токсичуВм (удары в минуту) Обработка соединением по примерам озиовка

r/Kã ность

Нет эффекта

Уровень

100 нг/кг

1 (ТК7) 2 (TK7 D) +38,2

Пир-Про-ТрпИет-NH для

2. сравнения

8425 -29,5

100 8540 -29,6

Необработанная контрольная группа

11958

Обработанная контрольная группа

10336 -13,6

Таблица 2

Показатели

Группа животных

t ) 1 2

Количество животных 2

ТК-7 (по примеру 1) NaC1 физиолог.

Обработка соединением

50 нг/кг веса

0,1 мл/кг веса

Доза

12,5 14,8

Начальный вес, кг

11,7

l0 14072 +17,7

50 15093 . +26,2

100 16180 +35,3

10 13377 +11,9

50 14280 +19,4

100 16866 +41,0

10 12106 +1,2

+36,1

+46,0

+56,5

+29,4

+63,2

+17,3 — 18,5 — 17,4

1342424

Продолжение табл.2

Показатели

Вес, кг, через 1 неделю

Ф

14,0 16,3

16,0 18,5

19,3 20,5

6,8 5,7

54;4 38,5

15,2

20,7

9,0

Привес, кг

76,9

+32,4

-16,2

g X к контролю

Расход пищи, кг

21 21

3,09 3,68

2,33

Эффективность корма, $ 7 к контрольной группе

-24,6

+19,1

Составитель В.Волкова

Редактор 10.Ñåðåäà Техред И.Попович Корректор Н. Король

Заказ 4447/58

Тираж 347 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4