Способ получения антисыворотки к инсулину

Способ получения антисыворотки к инсулину

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии и медицине, точнее к способам получения антисывороток к гормонам. Предназначенным для разработки и создания разноиммунологических систем (при определении гормонов в сыворотке или плазме гфови); как компонент радиодиагностических наборов для определения гормонов при их серийнопромышленном выпуске; дпя анализа гормонов другими иммунологическими тестами. - иммунопреципитацией, иммуноэлектрофорезом и пр. Цель изобретения - повышение титра сыворотки, Для этого инсулин эмульгируют с рав- ,ным объемом полного адьюванта Фрейда , чередуют его введение с введением инсулина, ковалентно связанного с сефарозой, активированной бромцианом, или коньюгированного с гидроокисью алюминия. Эти антигенные смеси вводят внутрикожно во множество точек спины, и шеи. Весь процесс иммунизации состоит из 10-ти циклов. Хорошие характеристики полученных антисывороток к инсулину позволяет использовать их в иммунологических методах для анализа инсулина, в частности в методах иммунодиффузии (иммунопреципитаЦия в агаре и агарозе, иммуноэлектрофорез и др.). сл со 4 СО о 4 О5

C(M3 COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (su 4 А 6! К 39/39 ив

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТОЕННЫЙ HOMHTET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (46) 23.06. 88. Бюль Ф 23 (2 I ) 3806749/28-! 4 (22) 30. IO. 84 (7 !) Институт биоорганической химии АН БССР (72) В.Л. Чащин, Н.В. Пивень, Н.А. Корень и В.В. Цыбовская (53) й!5.373 (008.8) (56) Ляшко К.Я., Михайлова В.С., Древаль А.В. Экспериментальное получение антиинсулиновой сыворотки у морских свинок и ее практическое применение в радиоиммунологическом методе определения инсулина, Лабораторное дело, !974, !! 2, стр, 85-88. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ

К ИНСУЛИНУ (57) Изобретение относится к биохимии и медицине, точнее к способам получения антисывороток к гормонам, предназначенным для разработки и cosдания раэноиммунологических систем (при определении гормонов в сыворотке или плазме крови); как компонент

„„SU„„1349046 А 1. радиодиагностических наборов для определения гормонов при их серийнопромышленном выпуске; для анализа гормонов другими иммунологическими тестами, — иммунопреципитацией, иммуноэлектрофореэом и пр, Бель изобретения — повышение титра сыворотки.

Для этого инсулин эмульгируют с рав„ ным объемом полного адьюванта Фрейда, чередуют его введение с введением инсулина, ковалентно связанного. с сефароэой, активированной бромцианом, или коньюгированного с гидроокисью алюминия. Эти антигенные смеси вводят внутрикожно во множество точек спины и шеи. Весь процесс иммунизации состоит из IO-ти циклов.

Хорошие характеристики полученных антисывороток к инсулину позвоЛиет испольвоввть ив в иммуиолотических методах для анализа инсулина, в частности в методах иммунодиффузии (иммунопреципитация в агаре и агароэе, иммуноэлектрофореэ и др.).

1 349046

Настоящее изобретение относится к биохимии и медицине,а именно к способам получения антисывороток к гормонам, которые могут быть использованы при раэррботке и создании радиоиммунологических систем для определения гормонов в сыворотке (плазме) крови; как компонент радиодиагностических наборов для определения гормонов при их серийно-промышленном выпуске; для анализа гормонов другими иммунологическими тестами — иммуиопреципитацией, иммуноэлектрофорезом и пр.

Целью изобретения является повышение титра сыворотки, Это достигается тем, что введение инсулина эмульгированного в полном адъюванте Фрейда чередуют с введением инсулина, ковалеитно связанного с сефароэой, активированной бромицианом, или коньюгированного с гидроокисью алюминия, причем названные антигенные смеси вводят внутрпкожно во множество точек спины и ще и ° .Пример. Приготовление антигена для иммунизации.

Антиген I. 5 единиц (0,2 мг) инсулина растворяют в 0,3 мл стерильного физиологического раствора, Для полного растворения инсулина добавляют к этому раствору 10-20 мкл 0,1 Н соляной кислоты. Полученный раствор инсулина тщательно эмугируют с

0,3 мл (равным объемом) полного адьюнанта Фрейда. Такую антигенную смесь используют для первого введения при иммунизации. Антиген 1 для третьего, пятого и нечетных введений готовят аналогичным способом из расчета на

5 единиц инсулина 0,3 мл физиологического раствора и 0,3 мл полного адьюванта Фреида.

Антиген II. Инсулин — BrCN-сефароза.

Посадку инсулина на сефароэу проводили по известной методике.

Лиофилнзованный препарат BrCN — сефаро=-ы суспеидируют в 1 mM НС1, дают набухнуть в течение 15 мин и промывают тем же раствором от консервирующих добавок. Количество ее берут иэ расчета посадки 5-10 мг белка на

I мл влажного сорбента с учетом то го, что i г лиофилиэированной сефароэы набухает до объема 3,5 мл.

После промывки обменник переводят в 0,1 И раствор ЯаНСОз (рН 8,3) с

1О

О>5 >!NaCI, В этом растворе обменник (l,4 г или 49 мл) в течение 2 ч перемешивают с 50 мг инс .гнна (раствор антигена 5 мг/мл) на встряхивателе при комнатной температуре (или в течение ночи на холоду). После окончания посадки антигена блокируют не занятые им активные центры сорбента.

Лля этого гель обрабатывают таким же образом в 1 М растворе этаноламина или 0,2 M растворе глицина при рН 8. Затем избытки белка и блокирующего агента отмывают тем же раствором бикарбоната с солг>ю> поТо> 0,1 М ацетатным буфером (рН 4) с добавкой

0,5 M NaCI и снова бикарбонатом, !

1ммуносорбент переводят в 0,01 M фосфатный буфер (рН 7,0) с 0,15 MNBCI, Гото вя т садки инсулина 1 мг/мл. Получения>й таким образом антиген вводят в количествах; приведенных в схеме 1, иэ расчета, что в О,! мл суспензии со держится О, 1 мг инсулина, Инсулин, коньыгированный с гидр ооки сью алюми ния .

Для первого введения а нти ген готовят следующим образом: 0,3;.>г инсулина растворяют в 0,3 мл физиологического стерильного раствора н до— бавляют 0,3 мл 17.-ной гидроокиси алюминия, все тщательно перемешнг>ают, 1%-ный раствор гпдроокнси ллюминня готовят перед употреблением иэ концентрированного раствора гидроокиси алюьмния. Для всех последующих введений антиген берут р количествах, указанных в схеме 1, из рас гета

0,1 мг инсулина на 0,1 мл cion:,нологического раствора.

Проведение иммунизации, Процесс иммунизации состоит из

10 циклов.

Первый цикл иммунизации включал шестикратное вну грикожное введение во множество точек спиггы и шеи антигенного материала каждь е 3 недели по следующей схеме:

Введение мг . антиген

1-ое 0,25 I

2-ое 0,3 11

3-ое 0,35 Т

4-ое 0,40 II

5-ое 0,45 I

6-ое 0,5 II

Количество вводимых компонентов антигенной смеси дается в расчете на

1 животное,пон этом 1 ед. = 0,0- >08 мг

1 3490 инсулина. Второй и I»cp и< следуюп<3»е цик<п» (до 10) состоят иэ однократного вв< дения каждые 30дцей анти гplt;<

I (четные цикль<) 1»1п» антигена TI (цечетные пп»клы) в дозах 0,3 мг иц5 сулина. Взят <е крови для тестирования проводят путем кардиальной пункции на 7-10 день после очередного введения антигена. 10

В исследуемо1» антисыворотке ра диоиммунологическим методом опредеА6 1

1,02-1, 75 10 л/.«!.»ь) ц <1«»сокоактивные ацтителл (ра< <цй титр антиCi)tP 1",ОТКЦ В ЕЦЯЛИТ<» 1Е<.КОЙ TP CT CHC э .ме 1:800000-1000000), «оторые удовлетворяют т ре бова иця м, цредъя вляе<»ь<м к ацтисыворот к ам, используемым для радиоцмнуц<.<огического аналиэа. Использование в утрикожць»х чере»Iyt

I . Титр антцсыворотки (величцну, обратную тому разведению антисыворотки, которая вызывает связывание

50K I — инсулина в аналитической

» » 5 тест-систе;".е ), ? . Константу ассоциац»»1» (xapa» Теризует сродство антител к ацтигp»lу), 3. С<1ец»»фи»ность антител (оцеш»вЂ” вает с. процент перекрестной ре акции с другими структурно-родственць»ми соедин пнями — пропп сули ном, глю»< а гоном, С-пептидом).

Титр антисыворотки после первого

25 цикла иммунизации в пределах

1: 10000 — 1: 30000; через 7-9 1<åcÿцев l: 70000 — 1: 100000; через 10-12 месяцев 1: 100000 — l: 250000, кто по- 30 зволялс в радиоцммуцологической тесФ-системе для определения ицсу:IFIна доводить развец<- ние антисы»эоротки (рабочий титр) до 1:400000 — 1:1000000 °

Величина константы ассоциаци»» зг

11

1 равна 1,02-1,73 !О л/мол.

Перекрестная реакция с проинсулином не более 107., с глюкагоцом

0,3,"7,, с С-пептидом — 0,057., что говорит о высокой специфичности получен- 4р ных антител.

Кроме того, антисыворотки тестиров<»лц методом двойной иммуцодиффу эии по Оухipp

9-11 месяцев после начала иммунизации.

В ре <ультате предложенного метода полу «цы»31 <соко снеццфичць<е (перекрест»»ая р..акция с проинсулицом не более 10,";, с гпюкаго»»ом — О, 3, с

С-пептидом — 0,05Я), высокоаффин»»ые (константа ассош»ации це ниж<э лет яльцост I жц B< ò III>)x oT р л э вития д»»абетцческой комы.

Состояц»»е иммунологической толерацтностц к ицсули»гу возникает через

<3-8 м< сяцев после начала иммуниза1»Hit. Раз»»цт<»е этогo состояния су<пес гвецно ограничивает воэможность эксперимента, т IF; как у морской свин"

F

У1»ел»»не ни е пр одо1<3«1»те.<п.ности периода выработки высокоактип»п<х антител без наступления с<эстоя}п»я и<слуцолог»»ческой то.<срацтности позИ<3 Я»1ЛО ПОЛУЧИТЬ ЯНТИГ1 tt

Формула из обретения

Способ получения ацтцсыворотки к инсулину путем иммуццз lt»tl» морских свинок инсулином с по »цым адъювантом

Фрейнда, о т ли ч а ю 1:<1» и с я тем, что, с целью по<31111,< ц«я титра

Составитель Л. Падюков

Редактор Л. Народная Техред М. Ходанич Корректор Н. Король

Закаэ 340l Тираж 655 Подпи сиое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретеннй и открытий

l 13035, Москва, Ж-35, Раувская наб., д. 4/5

Проиэводственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 сыворотки, животнык дополнительно иммунизируют комплексом инсулина с гидроокисью алюминия и комплексом! 349046 tj инсулина с сефароэой, при этом имму-, низацим осуществляют so множество точек спины и шеи подкожно.