Способ получения биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии

Способ получения биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии , в частности сорбента для аффинной хроматографии (САХ)формулы НО -SCH2CONH(CH2)6NHCH CH(OH)CH20-R -ОН где Е сефароза-4В, который используют для выделения белков из биологических жидкостей и тканей, в частности транскортина сыворотки крови. Для упрощения процесса получения САХ синтез ведут из 2-гидрокси-З(6-акиногексш1)-аминопропилсефароны-4В и Ы-гидроксисукциннмидного эфира ( 1 1 |J , 1 7 oi )-11,17-дигидрокси-3,20-диоксо-прегн- 4-ен-21-Ш1 - тиоЗ уксусной кислоты, взятого в 1,5- 3-кратном избытке по отношению к количеству концевых аминогрупп аминоапксилсефарозы в среде водного этанола или водного ацетона при содержании воды 5-40 мас.%. Способ упрощает технологию получения САХ за счет использования более дешевых и менее токсичных растворителей, а также большей устойчивостью промежуточного N- гидроксисукцинимидного эфира. (Л со ел со со со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)4 С 07 Х 31/00, 41/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

$СН2СОМН(СН2) 6МНСН2СН(ОН)СН 0 — Р

2 — ОН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3826461/31-04 (22) 14.12.84 (46) 15,11.87. Бюл. Ф 42 (71) Институт биоорганической химии

АН БССР (72) А.А. Ахрем, О.В. Гулякевич, А.Л. Михальчук, В.Н. Пшеничный и Л.И. Сурвило (53) 547.689 ° 6.07(088.8) (56) Samant В.R., Sweet F. Syhthesis

and cyciization of 21-hydroxyethylгде R — сефароза-4В, который используют для выделения белков из биологических жидкостей и тканей, в частности транскортина сыворотки крови.

Для упрощения процесса получения САХ синтез ведут из

2-гидрокси-3(6-аминогексил)-аминопропилсефароны-4В и N-гидроксисукцинимидного эфира (((I l Р, 17 а )-11,17-дигидрокси-3, 20-диоксо-прегн- 4-ен-21-ил— тио) уксусной кислоты, взятого в 1,5thiorogeståroïe . Derivat ives. — J. 0rt.

Chem., V.4l, 1976, -12,р. 2292-2299.

Авторское свидетельство СССР

М 1.162815, кл. С 07 J 5/00, 1983. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО СОРБЕНТА ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИН (57) Изобретение касается биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии, в частности сорбента для аффинной хроматографии (САХ)формулы

3-кратном избытке по отношению к количеству концевых аминогрупп аминоС: алксилсефарозы в среде водного этанола или водного ацетона прч содержании воды 5-40 мас.7. Способ угрощает ) технологию получения CAX за счет ис- 1.") ) пользования более дешевых и менее токсичных растворителей, а также боль- )„,, шеи устойчивостью промежуточного Мгидроксисукцинимидного эфира.

1гЭ

1 1351939 2

Изобретение относится к органичес- ния сорбента для аффинной хроматогракой химии, а именно к способу получе- фии формулы

8 CHIC ONH(CHg)gNHCHgCH(0H)CHgO — R

Π— -ОН

45 где R - остаток сефарозы-4В, который используется для выделения белков из биологических жидкостей и тканей и, в частности, транскорти- 15 на сыворотки крови.

Целью изобретения является упрощение процесса получения биоспецифического сорбента.

Поставленная цель достигается 20 путем использования в качестве аффинирующего агента биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии

N-гидроксисукцинимидного эфира (((11 Р, 17са )-11,17-дигидрокси3, 20-диоксопр егн-4-ен-2 1-ил| тио1 уксусной кислоты.

Дпя осуществления постадийного радиационного контроля при синтезе и особенно впоследствии при исполь- З0 зовании биоспецифического сорбента в синтезе сорбента используется радиоактивномеченный N-гидрокси-сукцинимидный эфир ((1,2,6,7 — Н)кортизол-21-.ил-21-тио) уксусной кислоты.

Пример 1. К 100 мл суспен.зии, содержащей 75 мл уплотненного геля 2-гидрокси-3(6-аминогексил))аминопропилсефарозы-4В, содержащего

27 мкмоль/мл концевых аминогрупп, 40 прибавляют при.перемешивании в течение 30-45 мин 200 мл спирта, избыток растворителя удаляют, доведя объем до 90-100 мл. К полученной таким образом водна-спиртовой (60K) суспензии аминоалкилсефарозы прибавляют

3,24 r (6,08 Ммоль) N-гидроксисукцинимидного эфира ((1,2,6,7 Н)кортизол21-ил-21-тио1уксусной кислоты в смеси 30 мл спирта и 10 мл ацетона и ос- 50 тавляют реакционную смесь при 15а

20 С. За ходом конъюгирования следят радиометрически по убыли радиоактивности в реакционном супернатанте. Согласно данным радиометрии конъюгирование завершается за 8-12 ч и последующее экспонирование не изменяет радиоактивности реактивности реакционного супернатанта. Через 20 ч гель отфильтровывают, промывают на фильтре спиртом (10x50 мл), 80Х-ным спиртом (Зх50 мл), 50Х-ным спиртом (Зх50 мл), 20Х-ным спиртом (3x50 мл), водой дистиллированной до 5000 мп.

Полученный таким образ эм водный гель биоспецифического сорб.нта при необходимости можно переве=ти в стандартный буфер или сразу после приготовления, или непосредственно перед использованием. Согласно данным раДиационного контроля остаточная радиоактивность супернатанта составила

75,5Х, а радиоактивность геля 24,5Х радиоактивности исходного эфира. Таким образом, полученная биоспецифическая матрица содержит 8,64 мг (19,87 мкмоль) (j(11 Р 17 Ы )-11,17дигидрокси-3, 20-диоксопрегн-4-ен21-ил) тио) уксусной кислоты на 1 мл уплотненного геля сорбента и.имеет емкость 73,6% от максимально возможной емкости исходной аминоалкилсефарозы.

Из промывных жидкостей возвращено

2,2 г (68Х от введенного в конъюгирование) N-гидроксисукцинимидного эфира ((1,2,6,7 — Н)кортизсл-21-ил-21-тио) уксусной кислоты.

Пример 2, К 100 мл суспензии, содержащей 75 мл уплотненного геля, укаэанной в примере 1 аминоалкилсефарозы, содержащеro 27 мкмоль/мл концевых аминогрупп, грибавляют при перемешивании в течение 1 ч 200 мл ацетона, дают отстояться, отделяют

200 мл супернатанта,а с остатком операцию повторяют. К полученной таким образом водно-ацетоновой (85-95X) суспензии аминоалкипсефарозы прибавляют 1,62 г (3,04 Имоль) N-гидроксисукцинимидного эфира „(1,2,6,7- H) кортизол-21-ил-21-тиос уксусной кислоты в 30 мл ацетона и оставляют реакционную смесь при 15-20 С. Осуществляя все последующие. операции аналогично примеру 1, получают биоспецифическую матрицу, содержащую 9,17 мг

135!939

Составитель И, Федосеева

Техред А.Кравчук

Редактор Э. Слиган

Корректор Л.Патай

Заказ 5538/21. Тираж 348

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

) (17, 2 мкмоль ) Ц(11 3, 1 7 с ) -1 1, 1 7дигидрокси-3» 20-диоксопрегн-4-ен21-ил) тио)уксусной кислоты на 1 мл уплотненного геля сорбента и имеющую емкость 63,7Х от максимально возможной емкости исходной аминоалкилсефарозы, Из промывных жидкостей возвращено

0,86 г (53K от введенного в конъюги- 10 рование N-гидроксисукцинимидного эфира ((1,2,6,7- Н)кортизол-21-ил-21тио1уксусной кислоты, где R — остаток сефарозы-4В, путем взаимодействия 2-гидрокси-3(6аминогексил)-аминопропилсефарозы-4В с производным g (11 Р 17 )-11, 17дигидрокси-3,20- диоксопрегн-4-ен-21ил) тио) уксусной кислоты в смеси органического растворителя с водой, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве производного (((ll P, 17е4 )-11, 17Способ получения биоспецифического сорбента значительно упрощает тех-. нологическую схему получения последнего, позволяет при необходимости гибко перестраивать производственный процесс и осуществлять наработку в необходимых объектах.

Формула изобретения, Способ получения биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии общей формулы дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21- ил) тио) уксусной кислоты используют

N-гидроксисукцинимидный эфир в 1,53-кратном избытке по отношению к количеству концевых аминогрупп 2-гидрокси-3(6-айиногексил)-аминопропилсефарозы-4В и процесс проводят в среде водного этанола или водного ацетона при содержании воды 5-40 мас.Х,