Способ очистки стафилококкового энтеротоксина типа а

Способ очистки стафилококкового энтеротоксина типа а

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа очистки стафилококкового энтеротиксина типа А. Цель изобретения - упрощение способа и повышение выхода целевого продукта. Очистку энтеротоксина осуществляют следующим образом. Токсинсодержащую культуральную жидкость концентрируют на мембранных фильтрах УПА-100 при давлении 0,7-1,0 атм и скорости потока 1 л/мин см², полученный концентрат доводят до pH 7,0 и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,01 М натрий-фосфатным буфетом (НФБ), pH 7,0, затем токсинсодержащую жидкость пропускают через колонку с КМ-целлюлозой, отбирают активные фракции и пропускают через колонку с гранулированным гидроксиапатитом, элюируют целевой продукт линейным градиентом 0,2 - 0,4 М НФБ. Выход 47%, степень очистки 99,99%. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения энтеротоксина типа А. Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта за счет использования комбинации сорбентов. П р и м е р. Токсинсодержащую культуральную жидкость концентрируют на мембранных фильтрах УПА-100 при давлении 0,7-1,0 атм и скорости потока 1 л/мин на 1 см поперечного сечения. Полученный 40-кратный концентрат разводят дистиллированной водой 1:10 и вновь концентрируют до заданного объема. Концентрат культуральной жидкости доводят до рН 7,0 и пропускают со скоростью 3 мл/мин через колонку (2,5 х 30 см) с с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,01 М натрий-фосфатным буфером (НФБ), рН 7,0. Первую фракцию, равную объему колонки и не содержащую белка, отбрасывают. Остаточный объем токсинсодержащей жидкости вытесняют из колонки одним объемом дистиллированной воды (рН 7,0) и присоединяют к основной фракции. Токсинсодержащую жидкость разводят дистиллированной водой 1:2 и доводят до рН 6,0. КМ-целлюлозу добавляют из расчета 20 г на 1 л раствора. Смесь перемешивают механической мешалкой в течение 1 ч. Затем катионит загружают в хроматографическую колонку размерами 1,8 х 20 см и промывают одним объемом 0,008 М НФБ в 0,008 М NaCl (рН 6,0). Элюцию проводят под контролем проточного спектрофотометра линейным градиентом 0,01 М НФБ (рН 6,0) 0,05 М НФБ (рН 6,8) со скоростью 1 мл/мин. Объем фракций, собираемых на хроматографическом коллекторе, 8 мл. Фракции, соответствующие белковому пику и содержащие токсин, объединяют, устанавливая рН 5,7. Раствор СЭА (стафилококковый энтеpотоксин типа А) со скоростью 1 мл/мин наносят на колонку (1,0 х 10 см) с гранулированным гидроксиапатитом, предварительно уравновешенным 0,03 М НФБ (рН 5,7), и промывают 1 объемом того же буфера. Элюцию проводят линейным градиентом 0,2-0,4 М НФБ (рН 5,7) со скоростью 1,5 мл/мин под контролем проточного спектрофотометра. Объем собираемых фракций составляет 5 мл, фракции, соответствующие белковому пику, объединяют и подвергают диализу против дистиллированной воды с целью освобождения от буферных солей. Конечный выход СЭА составляет 47% при степени очистки 99,99% Данные по выходу и очистке целевого продукта представлены в табл.1. и 2. Дисковый электрофорез в ПААГ-SDS показывает, что очищенный препарат СЭА содержит один компонент и, следовательно, является гомогенным. В реакции двойной гель-диффузии полученный препарат дает преципитацию со стафилококковой антиэнтеротоксической сывороткой типа А. Молекулярная масса энтеротоксина, определенная методом Weber и Osborn, равна 28000. Таким образом, предлагаемый метод является менее трудоемким за счет применения совокупности более технологичных операций (ультрафильтрация, исключающая сорбция на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматография на КМ-целлюлозе и ГГАП) и позволяет получать стафилококковой энтеротоксин типа А с высокой степенью очистки при большем конечном выходе препарата.

Формула изобретения

СПОСОБ ОЧИСТКИ СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А путем концентрирования токсинсодержащей культуральной жидкости ультрафильтрацией с последующей хроматографией концентрата и дополнительной очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, ультрафильтрацию осуществляют на мембранах УПА-100, хроматографию проводят на волокнистой ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,01 М натрий-фосфатным буфером, а дополнительную очистку проводят на колонках с КМ-целлюлозой и гранулированным гидроксиапатитом и элюируют целевой продукт линейным градиентом 0,2 - 0,4 М натрий-фосфатного буфера.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000