Штамм аzотовастеr снrоососсu @ для получения бактериального удобрения под томаты
Иллюстрации
Показать всеРеферат
Изобретение относится к микробиологической промышленности. Оно представляет собой штамм несимбиотического азот-фиксатора Azotobacter chroococcum ЦМПМ В-3344, способный специфически прикрепляться к корням томатов и вступать с томатами в ассоциативный симбиоз. Бактериальное удобрение с торфяным наполнителем, полученное на основе этого штамма, повышает урожай томатов на 29% и обладает долговременным действием. Штамм характеризуется повьш1енной выживаемостью клеток в торфяной среде . 7 табл. i (Л оо сд со ю to
2 А1
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)4 С 05 F 11 08
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3939752/31-13 (22) 26.07.85 (46) 15.12.87. Бюл. ¹- 46 (71) Институт генетики и цитологии
АН БССР (72) Н.А. Троицкий, M.À.. Новицкая, Т.M. Троицкая и В.M. Васильев (53) 576.8(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
¹ 11331166118899, кл. С 05 F 11/08,24.04.85. (54) IIITAMM AZOTOBACTER CHROOCOCCUM
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕ-, НИЯ ПОД ТОМАТЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности. Оно представляет собой штамм несимбиотического азот-фиксатора Azotobacter
chroococcum ЦМПМ В-3344, способный специфически прикрепляться к корням томатов и вступать с томатами в ассоциативный симбиоз. Бактериальное удобрение с торфяным наполнителем, полученное на основе этого штамма, повышает урожай томатов на 29Х и обладает долговременным действием.
Штамм характеризуется повьппенной вы- Сй (O живаемостью клеток в торфяной среде. 7 табл.
13592
Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой штамм Azotobacter chroococcum для получения бактериально5 го удобрения под томаты.
Целью изобретения является полу.чение нового штамма Azotobacter
chroococcum для производства бактериального удобрения, специфически по- 10 вышающего урожай томатов.
Штамм получен путем селекции одновременно на комплекс положительных признаков — сродство (способность прочно прикрепляться) к поверхности корней томатов, размножение на корнях в присутствии определенной почвы, конкурентоспособность с ее естественной микрофлорой. Методика селекции заключалась в многоступенча- 20 том отборе клеток азотобактера, прочно связанных с поверхностью корней томатов после длительного выращивания обработанных большим количеством клеток исходного штамма азотобактера 25 проростков томатов в нестерильной почве. Для исключения случаев отбора природных клеток азотобактера (как это случалось при использовании известных методов селекции) в исходную культуру клеток вводилась генетичес.кая метка. Клоны, отобранные с поверхности корней и способные при последующей обработке колонизировать корневую систему (показывать сплошное обрастание корней), отличались от исходного штамма-прототипа наличием и повышенным синтезом определенных экзобелков, обнаруживаемых при гель-эктрофорезе. 40
Специализированный штамм селекционировался затем на способность размножаться в торфяной среде — субстрате для получения бактериального удобрения.
Полученный штамм назван авторами
Azotobacter chroococcum Т-12 и депонирован в Центральном Музее промьппленных микроорганизмов ВНИИгенетики под ¹ В-3344.
Штамм Azotobacter chroococcum
ЦМПМ В-3344 имеет следующие характеристики.
Культурально-морфологические особенности штамма. Крупная короткая
55 палочка с закругленными концами, имеются жгутики, протоплазма у молодых клекток гомогенная и блестящая.
Клетка одета капсулой. Покоящаяся
Состав питательной среды для культивирования штамма в ферментере приведен в табл. 1.
Таблица 1
Расход на 30-литровый ферментер, r
Концентрация, г/л
Компоненты
195,0
10, 00
0,64
Сахар пищевой
K НР0
КН РО
MgSO, 12,5
0,16
3,1
0,20
3,9
NaC1
0,20
3,9
1,0
CaS04 2 Н О
Ма МоО, FeSO
0,05
0,001
0,003
0,002
0,006
Дрожжевой экстракт
0,5
9,8
Пеногаситель (олеиновая к-та) 1,95
0,1
72 2 форма — циста. Молодая культура бесцветна, старая — коричневая.
Продукт, синтезируемый штаммом.
Гетероауксин„ витамины группы В, гиббереллины, фиксирует молекулярный азот.
Аэотфиксирующая активность определяется ацетиленовым методом на хроматографе.
Способ, условия и состав среды для хранения штамма. На косяках агаризованной среды Burk под минеральным маслом при 5 С 1 год. Состав среды Burk на 1 л: К НР04 0,64, г;
КН РО 0,16 г; MgSO< 0,2 г; NaC1
0,2 г; CaSO4 2HzO 0,05 г; NazMo04
1 мг; FeSO< 3 мг; сахароза 20 r.
Способ, условия и состав сред для размножения штамма. Поверхность агаризованной среды Burk, t=28 С.
Условия и состав сред для ферментации. Аэрация. !
13592
2 3
Вода водопроводная, л
19,5
Таблица 2
Влияние бактериального удобрения на основе штамма Azotobacter сЬгоососситп ЦМПМ В-3344 на томаты.
Дата начала цветения
Средний вес Урожай, одноro пло- кг/м
Опыт
Толщина стебля, мм
Содержание витамина С мг/100 г сырого веса да, г
1/XI
2,4. 26,4+ 1,1
3,1 30,2+ 1,6
80-90
80-110
Контроль
23/Х
Опыт
Прибавка, X
14
20 рН 6,8-7,0 доводится 20Х-ным раст- 10 вором NaOH или разбавленной НС1
Свойство штамма Azotobacter chroo- 15 соссшп ЦМПМ В-3344 — прикрепляться к корням томатов и в результате этого повышать их урожай стабильно.
Стабильность штамма проверялась путем испытания его в производствен- 2р ных условиях. Штамм, прошедший более
70 пересевов на агаризованную среду
Бэрка и 5 месячное культивирование в торфе, был внесен под культуру томата сорта Русич. Через 117 дней после 25 бактеризации сеянцев томатов их корТехнология заводского приготовления препарата.
Штамм ЦМПМ В-3344 выращивают в ферментере на модифицированной среде Бэрка (состав среды приведен в Б0 табл. 3) с аэрацией до концентрации ч
10 кл/мл и культуральную жидкость инокулируют в полиэтиленовые пакеты с простерилизованным гамма-лучами в
4 дозе 2 ° 10 г измельченным торфом. Соотношение массы инокулята и торфа
1:3. После доращивания в термостате (при 28 С) в течение 3 сут удобрение готово к использованию.
72 4 ни были извлечены из почвы, отмыты от нее и разложены на поверхности агариэованной среды Бэрка. Через
48 ч корни были по всей длине покрыты колониями штамма ЦМЛМ В-3344. Прибавка урожая в опыте составила
37,27. Средний вес одного зрелого плода в контроле 54,75 г, в опыте
70,06 г.
Пример. Штамм размножают на агаризованной среде Бэрка, вносят в почву теплицы с добавлением в нее мела 5 г/кг, К<НРО4 0,4 г/кг, этилового спирта 6 мл/кг и подращивают
2 сут при 30 С в герметичных полиэтиленовых мешках (по 0,5 кг препарата в каждом), наполненных воздухом.
Количество азотобактера в 1 r препарата 10 -10 клеток,. Препарат внов сят в корневую систему растений томата при высадке.их в грунт теплицы.
Контролем служат растения, не.обработанные препаратом.
Сравнительные данные приведены в табл. 2.
Известные штаммы Azotobacter
chroococcum не живут на поверхности корней и не формируют симбиотических ассоциаций с растениями. Их полезное действие проявляется, например, на томатах в кратковременной ростостимуляции, что ведет к повышению урожаев лишь при первых сборах плодов.
Колонизация корней томата поСле инокуляции почвы штамм-прототипом К и штаммом ЦМПМ В-3344 исследовалась методом обрастания. Через 18 дней после инокуляции корни томатов отмывали от почвы, взвешивали и рас135927
Т а блица 4
Расход 15 на 30-литровый ферментер, г
Концентрация, г/л
Компоненты
195,0 20
Штамм
10,00
Сахар пищевой
Биомасса надземной части томата, %
Био0,64 масса корней, %
12,5
К НРО
КН РО
М@БО, 0,16
3,1 почва песок песок
3,9
0,20
0,20
3,9
NaC1
К(прототип) (контрольный) CaSO4 2Н О
NazMoO, Ре SOq
1,0 30
0,002
0,05
100
100
100
0,001
0,003
ЦМПМ В-3344 (опыт) 120,7 128
179
0,006
I
Дрожжевой экстракт
9,8
0,5
Пеногаситель (олеиновая к-та) 0,1
1,95
Вода водопроводная, л
19,5 кладывали на поверхность агаризованной среды Бэрка. Через 3 сут определяли обрастание корней. B контроле после обработки штаммом К-прототипом
5 обнаружена одна колония штамма-прототипа на 1 r корней. В опыте пос ле обработки предлагаеМым штаммом наблюдали сплошное обрастание корней клетками этого штамма. 10
Таблица 3
Состав модифицированной среды
Бэрка рН 6,8-7,0 доводится 20%-ным раствором NaOH или разбавленной НС1
Сравнительное исследование влияния обработки культуры томата клетка50 ми прототипа (штамма К) и штамма
ЦМПМ В-3344 на рост биомассы томата.
Корни рассады томата при пикировке обмакивают в звесь с одинаковой концентрацией клеток штамма К (контроль)
55 и специализированного штамма (опыт) и высаживают в почву. Через 18 дней
2 6 вегетации определяют массу надземной части растений. Масса в опыте превысила массу в контроле на 20,7%. При высадке рассады томата после обработки бактериями в песок, преимущества в действии специализированного штамма над штаммом-прототипом еще более значительны: масса надземной части растений увеличивается на 28%, а масса. корней на 79%. Эти данные сведены в табл. 4.
Влияние суспензии клеток Azotobacter chpoococcum на прирост биомассы томатов.
При исследовании корневой системы растений в опыте обнаружено сплошное обрастание поверхности корней клетками штамма ЦМПМ В-3344, в то время как в контроле наблюдались лишь единичные колонии штамма К.
Штамм увеличивает продолжительность полезного действия бактериального удобрения за счет большего времени функционирования в корневой системе. Исследование кинетики прибавки урожая томатов в производственных условиях показало, что после обработки рассады прибавка сохраняется на протяжении всех 11 сборов в течение
1,5 мес, в то же время при обработке природными штаммами, в том числе штаммом К, прибавка урожая наблюдается только в первых сборах.
Это показано в табл. 5 и 6.
1359272
Таблица 5
Результаты производственных испытаний влияния обработки корней рассады томатов сорта Реанте бактериальным удобрением на основе штамма ЦМПМ В-3344 на урожай.
Урожай томатов по месяцам, кг
Опыт май июнь июль тябрь всего
Контрольный участок (250 мг) 186 587 461
1761
191
336
Обработка удобрением (250 м ) 406 267 701
549 223
2146
21,8
19,1 16,7
20,8 43,5 20,4
Прибавка урожая, Х
Таблица 6
Динамика сбора плодов томатов в грунтовой таблице после обработки рассады бактериальным удобрением на основе штамма ЦМПМ В-3344 в сравнении с прототипом, 1984-1985 гг.
Действующее начало Сбор плодов по месяцам, кг/м удобрения декабрь январь февраль март апрель всего
0,4
0,7 0,71
Штамм К
0,73 0,4 2,94
Штамм ЦМПМ
В-3344
0,8 0,95
14 34
0,6
0,8 0,62 3,77
9 55 28
Разница, Х
Как видно из таблицы, применение удобрения на торфяной основе дало прибавку урожая в 1,5 кг плодов с каждого м опытной делянки, или в среднем на 21,8Х.
Как видно из таблицы, прибавка урожая по сравнению с прототипом сохранилась на протяжении всего периода сбора урожая.
Преимущество штамма Azotobacter
chroococcum В-3344 над К (этого же вида) особенно четко проявляется при изменении почвенных условий. Так, попытка применения штамма К для повышения урожая томатов в грунтовой теплице ИФ и БР AH Таджикской ССР оказалась безуспешной, тогда как
4б применение варианта специализированного штамма ЦМПМ В-3344, селекционированного для культуры томата сорта
Юрмалас, выращенного в данной почве, повысило урожай этого сорта томата на 40,9Х на опытной площади
1000 м и урожай сорта Майкопский урожайный на 29Х на площади 5000 м .
Это преимущество штамма ЦМПМ
В-3344 объясняется его приживаемостью в данной почве и ингибирующим действием почвы на штамм К. Вывод иллюстрируется опытом: в стерильную вытяжку из почвы грунтовой теплицы
ИФ и БР АН Таджикской CCP вносят
1359272
Таблица 7
Влияние обработки семян томата штаммами ЦМПМ В-3344, Т9 и К на урожай биомассы проростков.
Штаммы
Показатель
Т9 ЦМПИ К
В-3344
Биомасса надземной части на 1 растение, r 00, . 112 2 О0, . 117 7 О0, 11
По отношению
4о к штамму Т9, 100 142
Формула иэ обретения
1 Штамм Azotobacter chroococcum
ЦМПМ ВНИИ-генетика В-3344 для полур чения бактериальнога удобрения под томаты.
Составитель Л. Борисова
Редактор Н. Горват Техред М.Моргентал Корректор А. Ильин
Заказ 6111/24 Тираж 408 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 суспензию клеток варианта штамма
ЦМПМ В-3344 (опыт) и штамма К (конт троль) в концентрации 10 кл/мл, инкубируют при 28 С 4 сут с ежеднев5 ным измерением концентрации клеток во взвеси. В опыте во взвеси через
2 сут обнаружено 10 кл/мл штамма в
ЦМПМ В-3344. Роста культуры в контроле не наблюдается даже через 4 сут. 10
Использование предлагаемого специализированного штамма позволило получить торфяное удобрение с большим по сравнению с прототипом (порядка 10 кл/г) титром жизнеспособных 15
9 клеток и дольшей стабильностью при хранении.
Способность клеток штаммов расти и сохраняться в торфяной среде (торфяной порошок с добавлением извести 20 до pH=7 и компонентов питания вместе с культуральной жидкостью при инокуляции) исследовалась по сравнению с известным штаммом. С этой целью двухнедельную агаровую культуру штамма К смешивали со стерильным торфом, содержащим компоненты питательной среды, до начальной концентрации
10 кл/мл и хранили 2 мес при комнатной температуре, периодически опре- 30 деляя титр (количество) жизнеспособ, ных клеток. Через 8 дней титр упал на 2 порядка, через следующие
10 дней — еще в 120 раз. Через 2 мес инкубации жизнеспособные клетки не обнаруживались. Торфяной препарат специализированного штамма ЦМПМ
В-3344 готовили путем инъекции культуральной жидкости в концентрации
10 кл/мл в торфяную среду в соотношении торф: культуральная жидкость, равном 3:1, Через 2 сут хранения при комнатной температуре в препара7 те обнаружено 5,4 10 кл/г, еще через сутки - 5,6 10 кл/г. Следовательно, штамм ЦМПМ В-3344 обладает способностью к доращиванию на торфяной среде. Через 2 мес хранения тит составил порядка 10 кл/г торфяной среды. Таким образом, сохранность клеток специализированного штамма в торфяном удобрении выше, чем клеток штамма-прототипа.
Предложенный штамм специфически повышает урожай томатов. Штаммы, специфичные к другим растениям, например штамм Т-9, специфичный к ячменю, не оказывают такого эффекта, 1
Пример.Семена томатов сорта
Русич замачивали в суспензии торфяных препаратов штаммов IJMllM В-3344, Т9 и К с равной концентрацией жизнеспособных клеток, высевали в грунт и помещали под светоустановку. Через 25 сут взвешивали надземную часть растений.
Опыт проводили двукратно: в трех повторностях по 10 семян в каждом варианте. Средние результаты приведены в табл. 7.