Способ определения антиинфекционной активности биологически активного соединения

Способ определения антиинфекционной активности биологически активного соединения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области микробиологии и касается отбора биологически активных соединений (ВАС) с антимикробной направленностью. Цель изобретения - повышение точности способа за счет приближения способа к условиям макроорганизма. Сущность способа сводится к тому, что определяют МТД - минимальную токсическую дозу ВАС, культивируя эпителиальные клетки в среде, содержащей разные дозы ВАС; параллельно определяют минимальную ингибирующую концентрацию БАС, культивируя тестмикроорганизм в среде, содержащей разные дозы БАС, затем определяют степень подавления адгезии путем совместной инкубации зпителиальиых клеток и тест-микроорганизма в среде, содержащей дозы БАС, в 2 и более раз меньшие МТД. 4 табл. (Л Од СП со со

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

COUHAËÈÑÒÈ×ЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

59300 А 1 (19) (11) (51) 4 С 12 Q 1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕХХЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4019467/30-13 (22) 27.01.86 (46) 15.12,87., Бюл. Ф 46 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины и

Ленинградский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им.P.P.Âðåäåíà (72) К.Б.Грабовская, Г.Е.Афиногенов, Т.В.Копылова и А.А.Тотолян (53) 576.8.093.3 (088.8) (56) Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М.:

Медицина, 1982. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫК СОЕДИНЕНИЙ (57) Изобретение относится к области микробиологии и касается отбора биологически активных соединений (БАС) с антимикробной направленностью.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет приближения способа к условиям макроорганизма. Сущность способа сводится к тому, что определяют МТД вЂ” минимальную токсическую дозу БАС, культивируя эпителиальные клетки в среде, содержащей разные дозы БАС; параллельно определяют минимальную ингибирующую концентрацию БАС, культивируя тестмикроорганизм в среде, содержащей разные дозы БАС, затем определяют степень подавления адгезии путем совместной инкубации эпителиальных O клеток и тест-микроорганизма в среде, содержащей дозы БАС, в 2 и более раз меньшие МТД. 4 табл.

30

1 )3593

Изобретение относится к микробиологии и касается. отбора биологически активных соединений (БАС) с антимикробной направленностью.

Цепью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Определяют минимальную токсическую дозу (МТД) БАС, культивируя эпителиальные клетки в среде, содержащей разные дозы БАС. Доза, которая при выбранной экспозиции вызывает изменения в 50% клеток, считается 15 минимальной токсической.

Определяют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) биологически активных соединений, культивируя тест-микробы в среде, содержащей 20 разные дозы БАС, Та доза БАС, которая полностью подавляет рост бактерий, считается минимальной ингибирующей, Определяют степень подавления 25 адгезии путем совместной инкубации эпителиальных клеток и тест-микроба в среде, содержащей дозы БАС ниже или равной МИК, но в 2 и более раз ниже МТД.

Пример 1. Определение антиинфекционной активности и катапола на тест †систе стрептококка группы

А и тест-культуры эпителия НЕр-2.

Испытуемый БАС - катионный поли. о мерный антисептик катапол. Тест-микроб — стрептококк группы А, тип N2, 59. Среда для культивирования стрептококка -. мясо-пептонный бульон.

Среда для культивирования ткани — 10 5%-ный, гемогидролизат или среда 199.

Тест- культура эпителия — 48-часовой монослой НЕр-2, Определение МТД катапола.

Суспензию эпителиальных клеток 45

НЕр-2 в концентрации !00-200 тыс/мл вносят в пробирки с покровными стеклами (10 ?О мм) в объеме 2 мл на стекло. Монослой эпителия формируетсл в течение 48 ч при 37 С, после чего культуральную среду сливают и стекла с монослоем инкубируют в среце, содержащей катапол в,цозах 1

100 мкг/мл (табл.1). Для сравнения монослой инкубируют в среде без ка. тапола. Через 30 мин или 24 ч экспо"-.èöèè среду сливают, монослой фиксируют этанолом и окрашивают азур-эозином. Препараты исследуют под микроскопом, оценивая состояние клеток (целостность монослоя, отсутствие или наличие дегенеративных изменений в клетках) по сравнению с контролем.

Из данных табл.! следует, что

30-минутная экспозиция монослоя с катаполом в дозе 50-100 мкг/мл приводит к появлению первых признаков цитотоксического эффекта (число кле-. ток с явлениями дегенерации в 2 ра- за больше, чем в контроле). При длительной экспозиции (24 ч) основная масса клеток (75%), инкубированных с катаполом в дозе 30 мкг/мл, дегенерирована, что свидетельствует о цитотоксическом эффекте. Болыпие дозы катапола приводят к гибели всех клеток и разрушению монослоя.

Таким образом, МТД катапола при короткой экспозиции — больше

100 мкг/мл, а при длительной экспозиции — 15 мкг/мл.

Определение МИК катапола.

В питательную среду, содержащую катапол в дозах 1,25-25 мкг/мл, вносят одинаковую посевную дозу стрептококка (1 10 КФЕ). Через 24 ч инку5 бации при 37 С отмечают выраженность роста по помутнению среды в каждой пробирке по сравнению с контрольной (среда без катапола). Степень помутнения среды в процессе роста может быть определена количественно на спектрофотометре при длине волны проходящего света 650 нм. Для количественного определения числа жизнеспособных клеток из пробирок с заметным помутнением среды готовят серию десятикратнь|х разведений, высеваемых на чашки с плотной питательной средой. По .числу колоний, формирующихся на чашках через 24 ч

0 инкубации при 37 С, судят о концентрации бактерий в опытной и контрольной пробах. В данном опыте МИК катапола цля стрептококка группы А—

25 мкг/мл.

Определение степени подавления адгезии катаполом.

В пробирки с монослоем эпителия

НЕр-2 вносят 2 мл среды, содержащей катапол в дозах 5 — 100 мкг/мл и

0,2 мл суспензии стрептококка стандартной густоты (О,i при длине волны

650 нм). Смесь инкубируют 30 мин о при 37 С, клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой физиологического

1359300 раствора, фиксируют, окрашивают азур-эозином и исследуют под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем (среда без БАС). При этом подсчитывают число инфицированньж клеток эпителия (ИКЭ), среднее число кокков на одной эпителиальной клетке (х) и индекс инфицирования монослоя (ИИ), умножая ИКЭ на х, и выражают его в Х по отношению к контролю, принимаемому за 100Х.

Адгезивные свойства стрептококка группы А, преинкубированного с разными дозами катапола, приведены в табл. 2..

Из таблицы 2 видно, что в двух независимых постановках эксперимента удается получить хороший эффект ингибирования адгезии дозой 10

100 мкг/мл. В 2 раза меньшая доза (5 мкг/мл) неэффективна, а использование дозы более 100 мкг/мл приводит к проявлению цитотоксического эффекта и разрушению монослоя.

Адгезивные свойства различных видов бактерий к культуре клеток различного происхождения приведены в табл.3.

Из табл.3 видно, что различные клетки проявляют неодинаковую чувствительность к инфекции исследованными возбудителями, выделенными из клинического материала.

Влияние БАС на адгезию разных видов возбудителей к нормальным клеткам человека (вагинальный эпителий) приведено в табл.4.

Как видно из табл.4, антиинфекционная активность БАС выражена поразному в зависимости от возбудителя.

Поскольку MTK хлоргексидина для вагинальных клеток равна 100 мкг/мл, то титрование антиинфекционной активности начинают с дозы 50 мкг/мл (МТК:2). Эффективные дозы, подавляющие инфекционность псевдомонад, находятся в интервале 5-50 мкг/мл, а выбор дозы определяется тяжестью инфекции.

40

45, эпителиальных клеток — тест-микроор50

Катапол активен при стафилококковой и псевдомонадной инфекции, причем по отношению к стафилококковой он эффективен в интервале 5

50 мкг/мл, в то время как по отношению к псевдомонадной — только в дозе 50 мгк/мл.

Катамин — наиболее токсичный для клеток препарат, что позволяет егб использовать в концентрации не более 25 мкг/мл.

Таким образом, использование способа позволяет повысить точность определения антиинфекционной активности препаратов за счет приближения способа к условиям макроорганизма, учесть также бактериостатический эффект и влияние препаратов на адгезионность возбудителя. Способ не требует использования экспериментальных животных.

Формула изобретения

Способ определения антиинфекционной активности биологически активного соединения путем инкубирования различньгх доз исследуемого биологически активного соединения с тесткультурой микроорганизмов и определения минимальной ингибирующей концентрации его по отношению к тестмикроорганизму, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют минимальную токсическую дозу исследуемого соединения по отношению к культуре эпителиальных клеток, а затем определяют степень адгезии тест-микроорганизма путем добавления различньгх- доз исследуемого соединения в систему культура ганизм, при этом используют исходную дозу соединения, не превышающую 50Х минимальной токсической дозы, и антиинфекционную активность соединения определяют по степени подавления адгезии тест-микроорганизма.

1359300

Таблица 1

Состояние клеток после инкубации, ч

o,ç J > ) { I(a нт роль) 9% клеток с дегенерацией

1!% клеток с дегенерацией

50 дегенерации

100

30% То же

Гибель монослоя

То же

Таблица 2

Доза катапола, 1 мкг у мл

ИКЭ,%

1-(Контроль) 40

2-1 о:-ттволь) р

5,2

100

3 j

100

Т а б л и ц а 3

Вид б ак

" p.piiA

Адгезивность на культуре ткани (ИИ) Щт, мм

КЛС1Г

»»4»

К1 Чего" hHp-2 ЧЕС

1970 6030

281 2450 2050

l .сев до - 150 монас

485 1500 2000

182 а

Испытуемая доза, мкг/мл

3% клеток с дегенерацией

4% клеток с нарушением формы

Не отличается от контроля 29% клеток с явлениями

Выраженная ва- /5% клеток куолизация с дегенераклеток цией

Показатели адгезни (; ) m, 1359300

Продолжение табл.3

Вид бак- Штамм терий

10 10

3320

204

Стафило- 8325 кокк

209 нт

1520

10 77 нт

10 533 200

132

399

15S2

752

61

Кандида 421 нт нт

Культура клеток почки собаки.

Культура клеток почки человека.

Культура клеток почки обезьяны.

Эпителий вагины.

+ «с

Таблица4

Показатели адгезии

Доза мкг/мл

БАС

Стафилококк

ИИ ЗИ, (Ж) Кандида

Псевдомонас

50 1735 48 10,08 99,8 710

25 3000 9,64 14,72 99,7 950

5,3

10 3000 9,64 2,4 99,9 790 0

5 3400 0 470 92,2 нт

50 757 77,2 2340 61,2 620 17,4

10 1840 44,6 4500 25,4 1360 0

Катапол(МТК=

100 мкг/мл) 5 1930 41,9 5100 15,4 820

Кат амин 25 (МТК=

50 нкг/мл) 63,4 820 0

18 3 790 0

0 нт

6030

750

3320

Контроль (среда без БАС) Хлоргексидин (МТК=

100 мкг/мл) Адгезивность на культуре ткани (ИИ) ИДСК RH Чего НЕр-2 ЧЕС

ИИ ЭИ,(ж) ИЛ ЭИ, (X) 763,6 77,0 2210

1012 69,5 4930

2710 18,4 6100