Способ получения конъюгатов

Способ получения конъюгатов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А3 (1Е (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К hATEHTV

° ). ° 1

1М

ОН

- -C2H5 сн н — — СН СН

ОСОСН СН СОДg ; OH

В в

СН 0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

<.:(21) 3721031/23-04 (22) 29. 03. 84 (31) 8308857 ° (32) 30. 03, 83 (33) СВ (46) 23.12.87 ° Бюл. № 47 (71) Лилли Индастриз Лимитед (GB) (72) Джордж Джозеф Каллинан (US), Джордж Фердинанд Роулэнд и Робин

Джордж Симмондс (СВ) (53) 547.945.1.07 (088.8) (56) Îngettu М., John Wiley and Bong.

Peptide Synthesis, 1976, р. 85-136.

Патент Великобритании № 2090837, кл. С 07 G 7/00, опублик. 1982. а) 4 С 07 В 519/04 С 07 К 17/02 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ иммуноглобулина или нммуноглобулинового фрагмента, содержащих от 5,8 до .14,3 винковых остатков общей формулы где 2g — иммуноглобулин или иммуноглобулиновый фрагмент;

R, — СООСН или СОНН

К - СН или СНО, отличающийся тем, что иммуноглобулин или нммуноглобулиновый фрагмент подвергают взаимодействию в водной среде при рН 8,6 с винковым алкалоидом общей формулы (I) где

2g замещен сложноэфирной N-гидроксисукцинимидогруппой, полученной взаимодействием 4-сукциноилвинкового алкалоида общей формулы (I), где 7g замещен на ОН-группу, И-гидрокси-, сукцинимида и 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимидо-мето-п.-толуол сульфоната.

1 13

Изобретение относится к новым иммуноглобулиновым (парным соединениям) конъюгатам с фармацевтическими свойствами, в особенности с цитостатическим действием.

Предлагаемые парные соединенияконъюгаты можно представить следующей формулой: оа

62404 2 тина, применяя глутаровый ангидрид вместо ангидрида янтарной кислоты.

Любое случайное ацилирование 3-ОН

-группы можно реверсировать путем обработки на влажном силикагеле в соответствии с процедурой. По другому варианту соединения можно очистить от любых 3-ацилпроизводных или других побочных продуктов реакции путем хроматографии обычно на силикагеле, используя в качестве раствора для элюирования смесь растворителя этилацетат/этанол.

Способ получения активированного

4-сукциноилдезацетилвинбластина.

1 г 4-сукциноилвиндезина смешивают с.380 мг N-метилморфолина в 20 мл метиленхлорида и добавляют 390 мг

С2Н5 !

ii

М

N ч

1, Р5 9 17

l5

Приведенную процедуру используют для получения 4-сукциноилвиндезина, 4-сукциноилдезацетилвинкристина, 4-сукциноил-4-эпидексидезацетилвинбластина.

Подобную процедуру используют для получения 4-глютароилдезацетилвинбласМ . C=0 Н3 н

9 снэ

СН2 (,H9O OCOCHZ(HZCO93

t OH

Й, где 3g — иммуноглобулин или иммуноглобулиновый фрагмент;

СООСН или СОЯН

R — СН или СНО. а

Цель изобретения — синтез новых конъюгатов иммуноглобулина или его фрагментов, обладающих более сильным и. селективным противоопухолевым действием по сравнению с винковыми основаниями.

Способ получения 4-сукциноилдезацетилвинбластина.

2 г 4-дезацетилвинбластина растворяют в пиридине, к раствору которого добавляют 2 r ангидрида янтарной кислоты. Реакционную смесь перемешивают . при температуре окружающей среды в течение 5 ч (для этой реакции можно использовать температуры в интервале

0-50 C). Летучие составляющие удаляют путем выпаривания в вакууме и остаток вводят в СН Cl . Слой СН Cl промывают 5%-ным водйыМ раствором бикарбоната натрия, а затем водой. Органический слой высушивают и растворитель из него удаляют в вакууме, что дает 4-сукциноилдезацетилвинбластин. изобутиллоформата. Реакционную смесь

20 перемешивают при температуре приблио зительно 0 C в атмосфере азота в течение приблизительно 45 мин. Добавляют 795 мг N-гидроксисукцинимида и реакционную смесь нагревают до температуры кипения раствора в атмосфере

N с перемешиванием в течение приб2 лизительно 45 мин. Реакционную смесь охлаждают. Охлажденную смесь промывают деионизированной водой и сразу же высушивают над На 80 . Осушающий

ЗО агент отделяют фильтрацией и фильтрат выпаривают до сухого состояния в вакууме.

Пример 1. Виндезинсукциноиловый конъюгат противомьппинного HrG кролика.

К раствору 4-сукциноилвандезина (25 мг) в сухом диметиформамиде (ДЕФА) (0,4 мл) добавляют при перемешивании 0,3 мл 11,4.мг/мл раствора

N-гидроксисукцинимида в сухом ДИФА и далее 0,3 мл 41,7 мг/мл раствора ляют при быстром перемешивании к

0,9 мл 10,7 мг/мл раствора кроличьего противомышинового HrG в 0,34 М боратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5,5 ч, продукт вьщеляют с помощью гель-фильтрации на колонке

1 27 см (21 мл) Био-Гель P-6, уравно1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-мето-р-толуолсульфоната в сухом ДМФА. Смесь выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 48 ч и получают 0,25 мг/мл раствора 4-сукциноилвиндезин-N-гид роксисукцинимидового сложного эфира.

90 мл упомянутого раствора добав3 13624 вешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Собирают исключенный пик (4,9 мл). Проверяют на содержание белка и виндеэина с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конъюгат, 5 приготовленный таким образом, содержит 7,9 моль виндезина на моль Иг.

Пример 2. Виндезинсукциноилмоноклональный конъюгат антиостеоген- 10 ной карциномы кролика.

300 мл 28 мг/мл раствора сложного

4-сукциноилвиндезин-N-гидроксисукцинимидового эфира в сухом ДМФА, приготовленного аналогично способу, описанному в примере 1, добавляют при быстром перемешивании к 4,5 мл

19,8 мг/мл раствора моноклональной антиостеогенной саркомы мыши в 0,34 M боратном буфере с рН 8,6. Смесь пере- 2 мешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, затем очищают с помощью центрифугирования и продукт выделяют с помощью гель-фильтрации всплывшей части на колонке 1,5 26,5 см (46,8 мл) 25

Био-Гель Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (5,52мл).

Определяют на наличие виндезина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конъюгат, приготовленный таким образом, содержит 8,7 моль виндезина на моль Иг.

Пример 3. Виндезинсукциноиловый конъюгат моноклонального анти35 меланомного антигена мьиии.

200 мл 20 мг/мл раствора 4-сукциноилвиндезинового сложного N-гидроксисукцинимидового эфира в сухом ДМФА приготовленного аналогично способу, описанному в примере 1, добавляют при быстром перемешивании к 1,0 мл

21,2 мг/мл раствору моноклонального антималеномного антигена мыши в

0,34 М боратном буфере с рН 8,6.

Смесь перемешивают при комнатной.температуре в течение 4 ч и продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на колонке 1,5 26 см (45,9 мл) Био-Гель

Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исклю50 ченный пик собирают (12,31 мл) и анализируют на содержание виндезина и белка на 270 и 280 нм. Конъюгат, приготовленный таким образом, содержит 9,1 моль виндезина на моль Иг.

55 1

Пример 4. Виндеэинсукциноиловый конъюгат моноклонального антикарциноэмбрионного антигена мыши.

04 4

1,0 мл 22 мг/мл раствора 4-сукциноилвиндеэинового сложного N-гидроксисукцинимидового эфира в сухом

ДМФА, приготовленного по способу, аналогичному по примеру 1, добавляют с быстрым перемешиванием к 7,0 мл

21,4 мг/мл раствора моноклонального антикарциноимбриогенного антигена мыши в 0,34 M боратном буфере с рН

8,6. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

4 ч, затем разбавляют 3,5 M хлорид натрия в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,4, и продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на 3, 2 24, 4 см (196 мл) на колонке Био-Гель P-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (28,24 мл) и анализируют на содержание виндезина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм;

Конъюгат, полученный таким образом, содержит 5, 8 моль виндезина на моль Иг.

Пример 5. Дезацетилвинбластинсукционоиловый конЪюгат кролика антимьппиного Иг.

К раствору 4-сукциноилдезацетилвинбластина (18 мг) в сухом ДМФА (0,4 мл) добавляют при перемешивании 0,3 мл 7,97 мг/мл раствора N-гидроксисукцинимида в ДМФА и далее 0,3 мл

14,4 мг/мл раствора 1,3-дициклогексикарбодиимида в сухом ДМФА. Смесь держат при комнатной температуре в темноте в течение 19 ч, получив 18 мг/мл раствора сложного 4-сукциноилдезацетилвинбластин-N-гидроксисукцинимидового эфира.

Добавляют 200 мл упомянутого раствора при быстром встряхивании к 1,8мл

8,02 мг/мл раствора кроличьего антимышиного Иг в 0,34 М боратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

3,5 ч, затем очищают центрифугированием, и продукт выделяют иэ всплывшей части с помощью гель-фильтрации на 1,5 2,5 см (44 мл) колонке БиоГель P-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера.

Исключенный пик собирают (6„47 мл) и анализируют на содержание дезацетилвинбластина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конь-, югат, полученный таким образом, содержит 9,0 моль дезацетилвинбластина на моль Иг. мыши.

К раствору 4-сукциноилдеэацетилвинкристина (10 мг) в сухом ДМФА (0,1 мл) добавляют при перемешивании

0,2 мл 6,5 мг/мл раствора N-гидроксисукцинимида в сухом ДМФА и далее 10

0,2 М 24,0 мг/мл раствора 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-мето-р-толуолсульфоната в сухом ДМФА.

Смесь выдерживают при комнатной. температуре в темноте в течение 65 ч, что дало 20 мг/мл раствора сложного

4-сукциноилдезацетилвинкристин-N-гидроксисукцинимидового эфира.

200 мл упомянутого раствора добав1 ляют при быстром перемешивании к 20

1,0 мл 22,7 мг/мл раствора монокло2 нального антимеланомного антигена мыши в 0,34 М рН

8,6. Смесь перемешивают при комнатнои температуре в течение 4 ч и про- 25

4 дукт выделяют с помощью гель-фильтрации на 3,2 24,5 см (197 мл) колонке

Био-Гель P-б, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают 30 (14,16 мл) и анализируют на содержа.ние белка и дезацетилвинкристина с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм.

Конъюгат, полученный таким образом, содержит 14 3 моль дезацетилвинкрис9

35 тина на моль Иг.

Пример 7. Дезацетилвинбластинсукциноиловый конъюгат антиаденокарциномы легких мыши.

Таблица 1

УФ-поглощение (оптическая плотность) Концентрация, мг/мл

Соединение по примеру о.d.270 о ° d,280

1,31

2,80

2,99

0 58

1,376

1, 319 2, 244 2, 334

0,707 0,786

0,97

0,369

2,034

1,909

0,91

0,108

0,261

0,236 0,256, 0,510 0,541

9 13624

Пример 6. Дезацетилвинкристинсукционоиловый конъюгат моноклонального антимеланомногo антигена

350 мл 14,7 мг/мл раствора 4-сук- 40 циноилдезацетилвинбластинового сложного N-гидроксисукцинимидового эфира в ДМФА добавляют при быстром перемешивании к 2,0 мл 20,0 мг/мл раствора моноклонального антигена антикарци- 45 номы легких малых клеток легких мыши

0,34 М боратном буфере с рН 8,6.После перемешивания при комнатной температуре в течение 4 ч реакционную смесь . доводят до рН 7,4, используя НС1, и 50 очищают центрифугированием. Продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на 2,0 22,0 см (67,0 мл) колонке БиоГель P-б, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера.

Исключенный пик собирают (9,7 мл) и подвергают анализу на содержание дезацетилвинбластина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конь04

6 югат, полученный таким образом, содержит 7,5 моль дезацетилвинбластина на моль ИГ.

Данные концентрации и УФ-поглощения по примерам 1-7 приведены в табл. 1.

Пример 8. Способ получения клеток, растущих в культуре. Их помещают в микротитровые трубки до уровня 10 клеток на трубку. Путем конs центрирования клеток центрифугированием добавляют 0,2 мл аликвот различных концентраций.конъюгатов. Клетки пересуспендируют, инкубируют при

37 С в течение 30 мин, затем центрифугируют и удаляют всплывшую часть.

Клетки затем суспендируют на тканевой культуре и помещают на микротитровые подносы для культур при уровне

Ф в 10 клеток на емкость. Через шесть дней в культуре определяют количество присутствующих клеток в каждой емкости и сранивают с клеточной формой приготовления, обработанной раствором соли с фосфатом в качестве буфера.

В одном эксперименте клетки меланомы человека обрабатывают либо виндезинсукциноиловым конъюгатом моноклонального антимеланомного антигена мыши (пример 3) или дезацетилвин7 1362404 кристинсукциноиловым конъюгатом моноклонального антимеланомного антигена мыши (пример 6) и устанавливают действие на рост клеток получая ре5 зультаты приведенные в табл. 2.

В другом эксперименте клетки колориктальной карциномы человека об.рабатывают виндезинсукциноиловым конъюгатом моноклонального антикари циноэмбрионного антигена мыши (приг мер 4), получая результаты, приве денные в табл. 3.

Продолжение табл.3

89,9

104,8

Пример 9. Для того, чтобы спытать in vivo действенность конъюатов в качестве противоопухолевых гентов группам мышей без волочковой железы подкожно имплантируют клеточную суспензию колоректальной карциномы и далее обрабатывают дважды в неделю с помощью внутрибрюшинных инъекций в течение пяти недель. Мышам вводят либо моноклональное антитело (про-, тивокарциномоэмбрионный антиген) мы20 ши с раствором соли с фосфатом в качестве буфера или виндезиновый коньюгат этого антитела, приготовленный, аналогично тому, как это описано в примере 4. Доза антитела, которую вводят за одну инъекцию мыши, варьирует между 3 3 и 3,7 мг. Доза виндезина в конъюгате для инъекции sa один раз на мышь составляет 119-128 Иг.

Спустя 61 день после того, как имплантировали опухоль, убивают группы, получавшие ПБС или одно антитело, опухоли извлекают и взвешивают. Мышей же, получивших виндезиновые коньюгаты с антителами, убивают спустя д 90 дней после имплантации опухоли.

Средние значения веса опухолей показаны в табл. 4.

Та блица 2

Концентрация конъюгированноro лекарственного

Конъюгированный лекарственный препарат ост клеток ак Ж контольных леток, обаботанных раствором соли с фосфатом в качестве буфера препарата, мг/мл

Виндезин

50

61,8

5,0

84,2

0 5

21,5

Дезацетилвинкристин

74,5

5,0

100,0

0 5

Таблица 4

Таблица 3

Средний вес опухолей, мг+С.Д.

Коли» чество мышей

Группа, получившая лекарства

ПБС

11 17931 1609

10 527 477

Только антитело

Виндеэинантителовый конъюгат

120

3,2

22 19

39,9

ВНИИПИ Заказ 6306/59 Тираж 372 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4