Способ получения аффинных сорбентов

Способ получения аффинных сорбентов

Реферат

 

Изобретение относится к области биоорганической химии и может быть использовано для получения аффинных сорбентов. Изобретение позволяет повысить выход сорбентов в расчете на использованный фрагмент нуклеиновой кислоты с 47 до 88% за счет использования в качестве носителя аминоцеллюлозы или аминосиликагеля и обработки фрагмента нуклеиновой кислоты смесью трифенилфосфина, дипиридилдисульфида и нуклеофильного катализатора, представляющего собой азотсодержащее гетероциклическое основание, при их молярном соотношении 1: 1: 1,76-2,08 соответственно.

Изобретение относится к области биоорганической химии и может быть использовано для получения аффинных сорбентов, необходимых для выделения определенных последовательностей нуклеиновых кислот, исследования дуплексов ДНК и РНК, а также для выделения ферментов. Целью изобретения является повышение выхода сорбентов в расчете на использованный фрагмент нуклеиновой кислоты. П р и м е р 1. 6,5 г [1,7 мкмоль, 130 оптических единиц при длине волны 260 нм (ОЕ₂₆₀)] додека(дезокситимидиловой кислоты (d(pT)₁₂) переводят в цетавлоновую соль триметилцетиламмонийбромидом. Соль нуклеотида растворяют в 300 мкл диметилформамида, добавляют в раствор катализатор 18 мг (150 мкмоль) 4-N, N'-диметиламинопиридина, 23 мг (85 мкмоль) трифенилфосфина, 18,7 мг (85 мкмоль) дипиридилдисульфида (молярное соотношение трифенилфосфин : дипиридилдисульфид : катализатор 1: 1: 1,76) и выдерживают реакционную смесь 10 мин при комнатной температуре. Полученное активное производное олигонуклеотида осаждают 1 мл 2% раствора перхлората лития в ацетоне. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром и сушат. Активное производное олигонуклеотида d(pT)₁₂ растворяют в 400 мкл 10 М раствора NaOH, рН 9, приливают к 150 мг аминоцеллюлозы и выдерживают реакционную смесь 12 ч при комнатной температуре. Полимер с присоединенным к нему олигонуклеотидом промывают водой, 1 М NaCl, водой, ацетоном, эфиром и сушат. Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте составляет 30 мг/г (600 Е/г). Степень присоединения олигонуклеотида 70% . Для проверки аффинных свойств через колонку с 10 мг полученного афинного сорбента пропускают раствора 0,70 ОЕ₂₆₀ олигонуклеотида тетрадека(дезоксиадениловой кислоты (d(pA)₁₄) или 1 ОЕ₂₆₀октадезоксинуклеотида с чередующимися основаниями аденина и цитозина (d(pAC)₄) в 0,5 М KCl, 0,1 М трис-HCl (рН 7,5), 10 М MgCl₂. Комплементарный олигонуклеотид d(pA)₁₄ связывается полностью, а не комплементарный d(pAC)₄ не связывается. Сорбционная емкость полученного сорбента 70 ОЕ/г. П р и м е р 2. 7 мг (2,7 мкмоль, 140 ОЕ) октадезоксинуклеотида d(pAC)₄ переводят в цетавлоновую соль триметилцетиламмонийбромидом. Соль нуклеотида растворяют в 300 мкл диметилформамида, добавляют в раствор катализатор 14 мкл (170 мкмоль) N-метилимидазола, 23 мг (85 мкмоль) трифенилфосфина, 12 мг (85 мкмоль) дипиридилдисульфида (молярное соотношение трифенилфорсфин: дипиридилдисульфид: катализатор 1: 1: 2) и выдерживают реакционную смесь 10 мин при комнатной температуре. Полученное активное производное октадезоксинуклеотида осаждают 1 мл 2% раствора перхлората лития в ацетоне. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром и сушат. Полученное активное производное олигонуклеотида d(pAC)₄растворяют в 600 мкл 10 М раствора NaOH, рН 9, приливают к 150 мг аминоцеллюлозы и выдерживают реакционную смесь 12 ч при комнатной температуре. Полимер с присоединенным олигонуклеотидом промывают водой, 1 М NaCl, водой, ацетоном, эфиром и сушат. Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте равно 32 мг/г (640 ОЕ/г). Степень присоединения олигонуклеотида 70% . Для проверки аффинных свойств через колонку с 10 мг полученного сорбента пропускают раствора 0,85 ОЕ₂₆₀ октадезоксинуклеотида с чередующимися основаниями гуанина и тиамина d(pCT)₄ или 1 ОЕ₂₆₀олигонуклеотида додека(дезокситимидиловой)кислоты d(pT)₁₂ в 0,5 М KCl, 0,1 М трис-HCl, 0,01 М MgCl₂ (рН 7,5). Комплементарный олигонуклеотид d(pCT)₄ связывается полностью, а не комплементарный d(pT)₁₂ не связывается. Сорбционная емкость полученного сорбента 85 ОЕ/г. П р и м е р 3. 3,5 г (1,35 мкмоль, 70 ОЕ) октадезоксирибонуклеотида d(pAC₄) переводят в цетавлоновую соль триметилцетитиламмоний бромидом. Полученную соль октануклеотида растворяют в 200 мкл диметилформамида, добавляют в раствор катализатор 10 мкл (120 мкмоль) N-метилимидазола, 10 мг (60 мкмоль) трифенилфосфина, 13,2 мг (60 мкмоль) дипиридилсульфида (молярное соотношение трифенилфосфин: дипиридилсульфид: катализатор 1: 1: 2) и выдерживают реакционную смесь 10 мин при комнатной температуре. Полученное активное производное октануклеотида осаждают 1 мл 2% раствора перхлората линия в ацетоне. Осадок промывают ацетоном, эфиром и сушат. Активное производное октануклеотида d(pAC)₄ растворяют в 300 мкл 10 М раствора NaOH, рН 9, приливают к 100 мг аминосиликагеля Li Chrosorb-NH₂ и выдерживают реакционную смесь 12 ч при комнатной температуре. Аминосиликагель с присоединенным октануклеодитом промывают водой, 1 М NaCl, водой, ацетоном, эфиром и сушат. Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте 25 мг/г (500 ОЕ), степень присоединения 71% . Для проверки аффинных свойств через колонку с 10 мг полученного сорбента пропускают раствор 1,2 ОЕ₂₆₀ олигонуклеотида d(pCT)₄ или 2 ОЕ олигонуклеотида d(pT)₁₂ в 0,5 М KCl, 0,1 М трис-HCl (рН 7,5), 0,01 М MgCl₂. Комплементарный олигонуклеотид d(pCT)₄ связывается полностью, а не комплементарный d(pT)₁₂ не связывается. Сорбционная емкость полученного сорбента 120 ОЕ/г. П р и м е р 4. 2,5 мг (0,5 мкмоль, 50 ОЕ) тетрадека(дезоксиадениловой) кислоты d(pA)₁₄ переводят в цетавлоновую соль триметилцетиламмонийбромидом. По- лученную соль растворяют в 200 мкл диметилсульфоксида, добавляют в раствор катализатор 9 мкл (110 мкмоль) N-метилимидазола, 14 мг (53 мкмоль) триметилфосфина, 11,7 (53 мкмоль) дипиридилсульфида (молярное соотношение трифенилфосфин: дипиридилдисульфид: катализатор 1: 1: 2,08) и выдерживают реакционную смесь 10 мин при комнатной температуре. Полученное активное производное олигонуклеода осаждают 1 мл 2% раствора перхлората лития в ацетоне. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром и сушат. Активное производное олигонуклеотида d(pA)₁₄ растворяют в 300 мкл 10 М раствора NaOH, рН 9, приливают к 50 мг аминоцеллюлозы и выдерживают реакционную смесь при комнатной температуре. Полимер с присоединенным олигонуклеотидом промывают водой, 1 М NaCl, водой, ацетоном, эфиром и сушат. Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте 44 сг/г (880 ОЕ/г). Степень присоединения 88% . Для проверки аффинных свойств через колонку с 10 мг полученного сорбента пропускают раствор 1 ОЕ₂₆₀ олигонуклеотида d(pT)₁₂ в 0,5 М КCl, 0,1 М трис-HCl (рН 7,5), 0,01 М MgCl₂. Комплементарный олигонуклеотид d(pT)₁₂ связывается полностью. Сорбционная емкость полученного сорбента 100 ОЕ/г. П р и м е р 5. 0,8 мг (0,4 мкмоль, 16 ОЕ) октадезоксинуклеотида d(pT)₈ переводят в цетавлоновую соль триметилцетиламмонийбромидом. К полученной соли нуклеотида добавляют катализатор 5,5 мг (40 мкмоль) N-окси-4-N, N'-диметиламинопиридина, а также 5,3 мг (20 мкмоль) трифенилфосфина и 4,4 мг (20 мкмоль) дипиридилдисульфида (молярное соотношение трифенилфосфин: дипиридилсульфид: катализатор 1: 1: 2) растворяют в 60 мкл диметилсульфоксида и выдерживают реакционную смесь 10 мин при комнатной температуре. Олигонуклеотидный материал осаждают 1 мл 2% раствора перхлората лития в ацетоне. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром и сушат. Осадок растворяют в 120 мкл 1 М раствора NaOH, рН 11, приливают к 20 мг аминосиликагеля (Li Chrosord-NH₂) и выдерживают реакционную смесь 12 ч при комнатной температуре. Полимер с присоединенным олигонуклеотидом промывают водой, 1 М NaCl, водой, ацетоном, эфиром и сушат. Содержание нуклеотидного материала в полученном продукте равно 22,5 мг/г (450 ОЕ/г). Степени присоединения 56% . Сорбционная емкость 108 ОЕ/г (по Poly A, 0,5 М NaCl, рН 7,5, 12^оС). Изобретение позволяет повысить выход сорбентов в расчете на использованный фрагмент нуклеиновой кислоты с 47% у прототипа до 88% . (56) P. T. Gilham "The covalent Binding of Nucleotides, Polynucleotides, and Nucleic Acids to Cellulose" in: Methods in Enzymology (Eds. Grossman L. , Moldave K. ), Academic Press, New-York, 1971, vol. XXI, р. 191-197.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ путем обpаботки фpагмента нуклеиновой кислоты активиpующим агентом с последующим подсоединением полученного фpагмента к носителю, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода соpбентов в pасчете на использованный фpагмент нуклеиновой кислоты, в качестве носителя используют аминоцеллюлозу или аминосиликатель, а в качестве активиpующего агента используют смесь тpифенилфосфина, дипиpидилдисульфида, и нуклеофильного катализатоpа, пpедставляющего собой азотсодеpжащее гетеpоциклическое основание, пpи их моляpном соотношении 1 : 1 : 1,76 - 2,08 соответственно.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 04.02.1995

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2002

Извещение опубликовано: 27.12.2002