Способ ферментативного получения пептидов

Способ ферментативного получения пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к пептидам , в частности к способу ферментативного получения пептидов общей формулы А-В, где А Н-концевой L-аминокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 L-аминокислот, содержащий L-аминокислоту (АК) на его С-терминальном конце и необязательно защитную группу на N-терминальном конце; В Ъ-аминокислотиый остаток , который может быть С-терминапьно защищен, применяемых в син- . тезе биологически активных соединений . Цель изобретения - упрощение процесса. Синтез пептидов ведут из аминокислотной (АКК) и субстратной компонент (СК) в растворе в присутствии фермента. В качестве АКК используют выбранные из группы соединения Н-В-ОН (в указано вьше); амид с необязательно N-замещенной АК формулы H-B-NHR ; сложный эфир АК формулы H-B-OR, где В указано выше; ОН; С -С4-алкил; ,-C4- алкил. В качестве СК используют выбранное из группы соединение: сложный эфир аминокислоты или пептида, или депсипептида формулы А - ОН,; амид АК или пептида формулы A-NHj или пептид формулы А.-Х, где А указано вьше; ,-С4-алкил, бензил или б г-дезамино-фрагмент Gly, Ala или Phe; А,Ъ-Ж-ИЛИ ди-пентапептид; . Процесс целесообразно проводить в дисперсии или з водном растворе , содержащем до 20% органического растворителя (низшего алканола, диметилформамида или полиэтиленгликоля) при рН 7,6-10,5, 25-45 0 и исходной концентрации СК 0,01-0,15 моль и АКК 0,05-3 моль с последующим выделением необязательного защищенного пептида, после чего при необходимости отщепляют группы Rj и R( с помощью серинкарбоксипептидазного энзима ( карбоксипептидаза-У из дрожжей или карбоксипептидазы СР-1-1 или СР-2-1 из проростков ячменя). Способ обеспечивает возможность проведения процесса в широком интервале рН 7,6- 10,5 при меньшем расходе фермента (до 2-25 ммоль). 2 з.п. ф-лы, 16 табл. S Од ч1 00 00 СП о

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3217951/23-04 (86) PCT/BK 80/00020 (01.04,80) (22) 05.12.80 (31) 1443/79 (32) 06.04.79 (33) DK (46) 29.02.88. Вюл. М 8 (71) Карлсберг Биотехнолоджи Цтд

А/С (DK) (72) Джек Таанинг Йохансен и Фред

Видпер (DK) (53) 547.964,4.07(088.8) (56) Xsova 11., Отюг М. Hyntes of рерМо1s vith groteolitic enzyms.ВпЗ 1. Селеш. Нос., Japan, 1977, 50,, 2762-65.

Патент Великобритании 1533129 кл.-С 07 С 103/52, опублик. 1978, (54) СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение относится к пептидам, в частности к способу ферментативного получения пептидов общей формулы А"В, где A=N-концевой L-аминокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 ?-аминокислот, содержащий L-аминокислоту (АК) на его С-терминальном конце и необязательно защитную группу на 11-терминальном конце; B=L-àìèíîêèñëîòíûé остаток, который может быть С-терминально защищен, применяемых в синтезе биологически активных соединений. Цель изобретения — упрощение процесса. Синтез пептидов ведут из аминокислотной (АКК) и субстратной 511 4 С 07 К 5/06, 5/08, 5/10, .7/06, 7/12,.С 12 Р 21/00 компонент (СК) в растворе в присутствии фермента. В качестве АКК используют выбранные из группы соединения Н-В-ОН (В указано выше); амид с необязательно И-замещенной АК формулы Н-В-NHR,; сложный эфир АК формулы Н-В-OR, где В указано выше;

С4 алкил. В качестве СК используют выбранное из группы соединение: сложный эфир аминокислоты или пептида, или депсипептида формулы А — ОВ,; амид АК или пептида формулы A-VHz или пептид формулы А,-Х, где А указано вьппе; R -С,-С<-алкил, бензил или Й-дезамийо-фрагмент Оlу, Ala. или

Phe; А„=?АК или ди-пентапептид;

К=1,-AK. Процесс целесообразно проводить в дисперсии или в водном растворе, содержащем до 20!. органического растворителя (низшего алканола, диметилформамида или полизтиленгликоля) при рН 7,6-10,5„ 25-45 С и исходной концентрации СК 0,01-0,15 моль и АКК 0,05-3 моль с последующим выделением необязательного защищенного пептида, после чего при необходимости отщепляют группы Н и Н,1 с помощью серинкарбоксипептидазного знзима (карбоксипептидаза-7 из дрожжей или карбоксипептидазы CP-1-1 или

СР-2-1 из проростков ячменя). Способ обеспечивает возможность проведения .процесса в широком интервале рН 7,610,5 при меньшем расходе фермента (до 2-25 ммоль). 2 з,п. ф-лы, 16 табл

1378785

Изобретение относится к способам ферментатинного получения пептидов, который может быть использован н синтезе биологически активных соеди5 нений.

Цель изобретения — упрощение процесса ферментативного синтеза пепти15 дов.

Исходные материалы, 10

Карбопенсидазу-У, получаемую из хлебопекарных дрожжей, выделяли с помощью хроматографии средстна, предложенной Йохансеном, и производили н виде лиофилизированного порошка (101 фермента н лимонно-кислом натрие),Перед использованием фермент обессолинали на установке "БерЬайех®

025 f inc" (1,5 25 см), уравновешивали и вымывали дистиллированной водой. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при условии

11

Е =14,8. Приготавливали основ 2ВО, ной раствор с концентрацией 7 мг/мл (110 мкмоль), хранившийся при -21 С, аликвотными порциями .по 250-500 мл.

Использовали бензоилаланинметиловый эфир (Hz-А1а-ОМе), выпускаемый фирмой "Бахем, Лишталь, Швейцария. Боро-трифторидный эфировый комплекс (для синтеза), растворители и реактивы (все аналитической чистоты) приобретали у фирмы "Мерк", Дармштадт, ФРГ. Все аминокислоты, аминокислотные амиды и их производные закупали у фирмы Сигма Кемикал Компани", Сан-Луис, США. Карбобензилоксифенилаланинметиловый эфир (Е-PheOMe,l изготавпивали в соответствии с процедурой Ямада и др. и использо40 вали в виде сиропа. Фенилаланингидразид, аланингидразид и аланингидразидгидрохлорид изготавливали из эфиров в соответствии с описанием Лоссе и др, Нескорректированные т,пл. составляли 86-88 и 184-185 С (по известным данным 82-83 и 184-185 С соо гнетственно). Аспарагинамиддигидрохлорид получали из аспартановой кислоты и диэтилоного эфира по Фише- 50 ру с помощью классического аминолиза (т.пл. 210-214 С, по известным данным 214-215 С), Другие исходные материалы приобретали у укаэанных фирм или производили аналогичным об- 55 разом.

Определение выходных продуктов.

Чистоту определяли количественно с помощью ТЬС на силикагеле 60

F (Мерк). Применяли растворительную систему СНС1, ;С.Н,(СН,)д, «ОН(СН СООН)Н О (11:5:2:1). Пятна визуально проверяли на тушение флуоресценции для оценки состава реагентов.

Состав реагентов определяли количественно на установке обращения фазы HPLC с помощью столба НР-8,10 мкм (Мерк) и хроматографа Хьюлетт Пакард

1084, снабженного регистратором переменной длины волны (модель 79875A).

Разделение обеспечивали при использовании соответствующих удельных градиентов в системах вымывания, составляющих от 10% СН>С1 н 10 ммоль

NaA<. (рН 4) до 100Х СН С11 или от

10 ммоль 1«1аАс (рН 4) до 100i! СН С l.

Последнюю систему использовали для таких соединений, как Hz-А1в,-01: -ОН, Hz-А1а-Ala-ОН, Hz-Ala- Her-ОН, и соответствующих амидон. Скорость протекания 3 мл/мин, температура столба о

47 С, рабочая длина волны 260 нм.

Выходы определяли из молярного отношения реагентов, которое находили по интегрированным площадям под пиками вымывания.

Идентификация продуктов, Пятна идентифицировали методами кохроматографии тонких слоев с соответстьующими стандартными соединениями, Некоторые продукты идентифицировали с помощью сочетания метода

НРЬС и аминокислотного анализа, Для этого из смеси реакции через 10 мин забирали аликвотные пробы объемом

1 мл и реакцию останавливали добавлением 250 мкл 6 М НС1, После этого рН доводили до 4 с помощью la0H и смесь разделяли методом НРЬС с по— мощью оборудования фирмы "Уотерс включающего дна насоса, программное устройство составления растворителей модели 660, инжектор модели ",6К, регистратор переменной длины волны модели 450, совмещенный с самописцем (радиометр НЕС 61), или о чописецинтегратор фирмы Хьюлетт-Пакард", модель 3380А. Управление вымыванием осуществляли с помощью сканирования на подходящей длине волны от 255 до

280 нм. Хроматографию осуществляли методом обратной фазы с помощью столба "Уотерс С-18М-Бондапак" и системе вымывания 20 об,/ ТЕАР (триметиламмониефосфатный буфер) в метаноле с соответствующими градиентами и скоростью потока 1,5-2,0 мл/мин, 1378785

Буферный раствор ТЕАР изготавливали по методике Ривьера. Во многих случаях удовлетворительные результаты обеспечивали в системе 0,1 M HAc, рН 3, 20 об ° %, и 0,1 М НАс рН 3 в метаноле.

Вытекающий поток, содержащий 11ацилдипептиды, собирали вручную и доводили до сухости путем лиофилиt1 зации или на установке Бюхи Рото-!

О вап" при 35-45 С, Малые пробы остатков гидролизовали в 6 М НС1 при

110" С в вакууме в течение 36 ч, Испаренные гидролизаты анализировали на аминокислотном анализаторе типа

"Даррум Д-500", Синтез со свободными аминокислотами в качестве аминовой компоненты.

Пример l. 2 мл 0,6 M раствора валина 0,1 M КС1, 1 М ЕНОТА при рН

9,8 смешивают со 100 мкл (О,I ммоль)

1 M раствора Hz-Ala-ONe (растворенных в 96%-ном этаноле). Реакцию прово-, .дят в рН-стате при 35 С и рН 9,8, причем значение рН поддерживают

25 постоянным путем автоматического добавления 0,5 М 1ЫОН, Реакцию инициируют добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У (150 0 /мг, производство

"Де Форенеде Брижерье"), После про- 30 текания реакции в течение 30 мин, реакцию останавливают с помощью доведения рН до 1 при посредстве 6 М НС1.

Продукт реакции очищают и выделяют с помощью хроматографии при высоком 35 давлении. Выход Вг-Ala-Val-OH составляет 40%. Количественный анализ аминокислоты после гидролиза продукта в 6 М HCl в течение 24 ч дает соответственно 1,0 моль аланина и

1,0 моль валина °

Влияние рН,,температуры и концентрации субстратной компоненты, аминовой компоненты и CPD-Y на выход

Âz-Аlа.- 1а. -ОН+СН ОН изучали с помощью пяти серий экспериментов, проведенных аналогично описанной процедуре, В каждом из экспериментов изменяли один из указанных параметров при постоянстве остальных четы50 рех: 0,6 М валин; 55 ммоль Hz-Ala-ОМе, 4, 5 мкмоль CPD- Y; рН 9, 7; 35 С. Полученные результаты показали, что диапазон оптимальных значений рН довольно узок и составляет всего

0,5 ед. рН, возрастание температуры . реакции приводит к почти линейному возрастанию синтеза иэ-за относительно слабого гидролиза. При температурах выше 45 "С с. ижение активности фермента и неферментативный гидролиз эфиров становятся неприемлемы- ми. При более низких температурах при рН до 10,0 гидролиз эфиров был пренебрежимо мал в течение 10 мин реакции. Однако он становился существенным при снижении скорости ферментативной реакции, когда длитель" ность реакции возрастала до 2-5 ч.

Выход Вк-А1а-Val-ОН увеличивался при возрастании концентрацчи аминовой компоненты. Обратная зависимость наблюдалась между выходом и концентрацией субстратной компоненты для Pz-Ala-OI lå. Это обстоятельство с учетом зависимости выхода от высокой концентрации фермента гозволяет найти оптимальное отношение субст— рата к концентрации фермента.

В присутствии 0,5 M валина субстрат Вк-Ala-OÌå быстро преобразовывался (в течение 20 мин) в 38% Вк-АВ.aVa1-0Н и 62% Bz-Ala-ОН. Эти цифры показывают также, что дипептид не гидролизовался при рН 9,7 в присутствии избыточного валина. Е ли рН доводили до 5-8, то весь Hz-А1а- Уa —

ОН гидролизовался за несколько секунд, Такое избирательное поведение

CPD-Y при высоких рН является свойством, имеющим важное значение при синтезе пептидов.

Пример 2. 2 мл раствора 3 М лизина, 0,1 М КС1, 1 мМ ЕГГА при рН

9,8 смешивают с 400 мкл 100%-ного метанола и 100 MKJI (0,1 ммоль) 1 М

Z-Phe-OMe (растворенного в 1007. — ном метаноле). Реакцию проводят аналогично примеру 1, ионизируя добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У. Через 30 мин рН доводят до 1 с помощью 6 M HC1. Продукт реакции очищают и выделяют способом хроматографии высокого давления. Выход Phc-Lys-OÍ достигает 60%. Количественный анализ аминокислот, производившийся аналогично примеру 1, показал, что в продукте содержался 1 моль лизина и

1 моль фенилаланина.

Пептиды, представленные в табл.l производили из указанных исходных материалов аналогично примерам 1 и

2. Эксперименты выполняли в радиометрическом рН-стате, а выходы определяли на установке HPLC. Поддерживали значения: 4,5 MKM CPD-У; pll

9,7; 35 С.

1378785

Синтез с амидами аминокислот в качестве аминовой компоненты.

Пример 3. 2 мл раствора

0,6 М метионинамида (Ме1-11На), 0,1 М

КС1, 1 мМ К1)ТА при рН 9,8 смешивают со 100 мкл (0,1 ммоль) раствора 1 М

Bz-Ala-ОМе в 96Х-ном метаноле. Реакцию проводят аналогично примеру 1, инициируя добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-Y. Через 30 мин после начала реакции значение рН доводят до 1 с помощью 6 М HCl. Продукт реакции очищают и выделяют способом хроматографии высокого давления. Выход Bz-Ala-Ме1-NHz 95Х. Количественный аминокислотный анализ, проводившийся так же, как в примере 1, показал, что продукт содержал 1,0 моль

А3а, 1,0 моль Met и 1,0 моль NH

В течение 20 мин субстрат почти полностью превращался в дипептид (95Х), à 5Х гидролизовалось до Bz-А1аОН.

Пример 4. 2 мл раствора 0,4 М25 валинамида (Val NH2), 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA при рН 9,5 смешивают со

100 мкл (0,1 ммоль) раствора 1 M BzAla-0Ìå в 96Х-ном метаноле. Реакцию проводят, как в примере 1. Продукт 30 реакции Bz-Ala-Val-NHz осаждают во время реакции, Через 20 мин после начала реакции рН доводят до 1 и осадок выделяют центрифугированием.Продукт растворяют в 1 мл 96Х-ного мета- 35 иола, очищают и выделяют способом хроматографии высокого давления. Выход Bz-А1а-Val-NH> составляет 95, в то время как в примере 1 при использовании свободной аминокислоты в 10 качестве аминовой компоненты, он был равен только 40Х, Количественный анализ аминокислоты, проводившийся так же, как в примере 1, показал, что продукт содержал 1,0 моль Ala, 1,0 моль Val и 1 0 моль NHЗ.

Зависимость протекания реакции от значения рН и от концентрации валинамида.

РеакциЮ проводили аналогично описанному синтезу, причем постоянные параметры составляли: 0,6 M валинамида; 55 мМ Bz-Ala-ОМе; 4,5 мкМ CPD-Y; рН 9,7; 35 С.

Полученные результаты показали, 55 что выход практически не зависит от концентрации валинамида.

Эффективное значение рН валинамида не превышает 9, значение рН 9,8 является верхним пределом, после которого выход сразу уменьшается.

Аналогично примерам 3 и 4 пептиды, приведенные в табл. 2, приготавливают из указанных исходных материалов. Эксперименты выполняют в следующих условиях: 4 мкМ CPD-Y; рН 9,6; 35 С. Концентрация субстрата приведена в табл. 2.

П р. и м е р 5. Синтез с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компоненты.

Аналогично примерам 3 и 4 пептиды, приведенные в табл.3 приготавли-. вали из указанных исходных материалов. Эксперименты проводили при

35 С, рН 9,6 в присутствии 4,5 мкМ

CPD-Y.

Пример 6. Синтез с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты.

Эксперименты с аминокислотными эфирами проводят так же, как в примерах 1-4: в радиометрическом рНо стате при рН от 9,0 до 9,7 и 23-35 С, Продукты и выход определяют с помощью HPLC. Концентрация CPD-Y составляла от 4,5 до 11 мкМ.

В табл. 4 приведены пептиды, получаемые из укаэанных исходных материалов. Видно, что в отдельных случаях имела место некоторая олигомериэация, Поскольку выходы обычно очень высоки, то аминокислотные эфиры можно считать пригодными для дальнейшего ограничения олигомериэации.

Пример 7, L- и Р-стереоизомеры в качестве аминовой компоненты.

Пентиды, приведенные в табл. 5. были получены иэ исходных продуктов так же, как в примерах 1-4 и 6.

Видно, что включаются только Lизомеры. В результате процесс становится экономичным, поскольку исключается необходимость очистки исходных аминокислот для получения чистого

L-иэомера.

Пример 8. Изменения субстратной эфирной группы.

Пептиды, приведенные в табл. 6, были получены иэ указанных исходных материалов так же, как в примерах

1-4.

Результаты доказывают гибкость предлагаемого способа по отношению к выбору субстратов.

Пептиды, приведенные в табл. 16, 40 были получены так же, как в примерах

1 и 3, при следующих условиях: 50 мМ субстрата, 0,25 мл геля CPD-Y (5 мкм о

CPD-Y); pH 9,7, 35 С. После удаления фермента путем фильтрации продукты и выходы определяли с помощью

НР1 С.

7 137878

Пример 9. Депсипептиды в качестве субстратов.

Как н примерах 3 и 4, пептиды, приведенные в табл. 7 были получе° у

5 ны из указанных исходных материалов °

Процесс проводили н присутствии

4,5 мкМ СР1)-У. при рН 7,6 25 С, Из табл. 7 видно, что обеспечиваются очень высокие выходы, 10

Пример 10. Пептиды н качестве субстратных компонент.

Пептидн, приведенные в табл, 8, были получены так же, как в примерах

l-4. Эксперименты проводили в радио15 метрическом рН-стате, выходы определяли с помощью HPLC. Постоянно поддерживали следующие параметры: 4-25 мкМ

CPD-Y, рН 7,6 при ?5 С.

Зависимость синтеза пептидов от рН.

В тех случаях, когда синтезируемые пептиды являются неподходящими субстратами для CPD-Y, синтез может выполняться при значениях рН предпочтительно 9-10,5, Пример 11, Так же, как н примерах 1 и 3, пептиды, приведенные в табл. 9, были получены в рН-стате при указанных значениях рН. о 30

Опыты проводили при 25 С в присутствии 15 мкмоль СРВ-У.

Другие аминовые компоненты, Пример 12. Пептиды, приведенные в табл. 10, были получены так же, как в примерах 3 и 4. Эксперимен- 35 ты выполняли н рН-стате, выходы определяли с помощью HPLC. Опыты проводили рН 4,5 мкМ CPD-Y, рН 9,5, 25 С.

П р и и е р 13. Синтез пептидов с ячменными карбоксипептидазами.

Прорастающий ячмень, например, в ниде солода содержит две различные карбоксипептидазы, обозначаемые

CP-1-1 и СР-2-1.

СР-1-1 и СР-2-1 изолировали по методике Рэн, пептиды, приведенные н табл. 11, были получены так же, как н примерах 1-4, из,указанных исходных материалов ° Поддерживали следующие условия: 6 мкМ СР-1-1 или

СР-2-1, рН 8.0, 25 С.

Пример 14. Диамидация пептидных амидов при катализе карбоксипептидазой.

К 2 мп раствора 15 мМ В -АХа-LeuNH2 в О,l М КС1, 1 мМ LDTA (рН 9,7, 25 С) н 1ОХ-ном диметилформамиде добавляли 2 мг СРП-Y. Результаты определяли с помощьro HPLC, как в при5 8 мере 1. Видно, что Bz-Ala Leu l через 20 мин полностью преобразовывался в 68i Bz-Ala-Leu-ÎÍ и 32_#_

Rz-Ala-ОН. Аминокислотный анализ среды реакции показал, что Bz-Ala-ÎÍ образуется главным образом в результате отщепления Leu-NH Bz-А1а2

Leu-11Н

Пример 15, Сравнение пептидно-эфирных субстратов с N-концевыми защитными группами и без них, Так же, как в примерах 3 и 4, пептиды, приведенные н табл, 12,были получены н следующих условиях: 50 мМ субстрата, 5 мкМ CPD-Y, рН 9,5, 25 С.

Пример 16, Синтез в присутствии органических растворителей.

Так же, как н примерах 1-4 и 6, пептиды, приведенные в табл. 13-15. были получены из указанных исходных материалов при указанных концентрациях органических растворителей, Поддерживали следующие условия:

50 мМ субстрата, 5 мкМ CPD-Y, рН 9,6, 30 С..

Пример 17, Нерастворимая (лишенная подвижности) карбоксипепсидаза-Y.

CPD-Y присоединяли к реактиву

"Конкавалин-А-Сефароза 4В", выпускаемому фирмой "Фармациа Файн Кемикалз", после чего формировали перекрестные связи между CPD-Y и Конкавалином А с глутаральдегидом, как описано Хсиас и Ройером. Концентрация CPD-У составила 3 мг на расфасованную Сефарозу.

Пример 18. Амиды пептидов в качестве субстратон.

Раствор 5 мл Bz-Ala-Leu-NH2 в

0,10 М КС1, 1 мл ЕПТА в присутствии

107. †но диметилформамида при рН о

10,0, 25 С смешивали с 0,25 М валинамида.

Реакцию инициировали добавлением

40 мМ СРР-Y и проводили аналогично примерам 3 и 4. Bz-ATa-Leu-Yal-NH2 выделяли методом HPLC с выходом порядка 651.

)378/8

Bz-Ar 11-ОеЛ рН 9 6 СРЛ У

Н-туг-КН, BZ-Arg — Ту1 — NH> (85о/о)

PH Sа СР — Y

B7 — Ar - Tyr-ОН (90 /о1

Е ОН / НС1

B7 — АГ0 — Tyr-Ое (ЦОо/, рн 9,0 Сж-V

H — Я у-ОИ

В .— А1 9 — ТУ -С1у — Оиру-ОМ (бОо/о) BZ — А -ТуГ-Яу-(„:1У-р1Е щ (б5о 1 о

Н вЂ” Туг — Яу-Яу — Pbe — Net,— ОН (95 /о) рН 890 Trfp lD

BZ-hr Ту 1.-С1у — Иу — РЬе — йе1-OН (75 /о 1. рН 9,5 CPO — 3

Н-Ие -OH

Bz — ЛГ Tyr-Яу-Gly — Phe — Ое (80о/о1

Е10Н/НС1

В -Arg — ту1-С1у-Gly — РЬŠ— ОН (95 /о) рН 9,5 сРВ -У

Реакцию повторяли с использованием Bz-А1e-РЫ--NH в качестве субст2 ратной компоненты. Bz-А1а-Phe- Yal-NH г выделяли методом HPLC с выходом по5 рядка 447..

Пример 19. Синтез мет-энкефалина.

Стадии катализируемой CPD-Y конденсации и деамидирования проводили в чистой водной фазе, à Bz-Агя был выбран в качестве солюбилизирующей защитной группы, которая может быть удалена на последней стадии с помощью трипсина. После расширения пептида под воздействием амида амина- 40 кислоты с последующим деамидированием, следующий пептидно-сложноэфирный субстрат синтезировали с помощью абсалютированного этанола и безводной

НС1. После каждой стадии реагенты 4 выделяли методом препаративной HPLC.

Таким способом могут быть также регенерированы избыток аминной компоненты и побочные продукты гидролиза

Предлагаемый способ позволяет упростить процесс ферментатинного получения пептидов за счет использования экзопеитидаз вместо применявшихся ранее ферментов, каждый из которых проявлял доминирующую или по мень шей мере значительную эндопептидазную активность, что позволяет расширить набор аминных и субстратных компонент, использовать ферментативный

Ступенчатый син;-ез мет-энкефалина при использовании в качестве исходного вещества 5 г Bz-Arg-Get, и в присутствии CPD-У в качестве катализатора проводили по следующей схеме: синтез мет-энкефалина с использованием в качестве катализатора

CPD-Y; выход для каждой стадии приведен в скобках, процесс для синтеза многозвенных биологически активных пептидов, Например энкефалина, значительно сократить использование защитных гругп, проводить стеноспецифический синтез, снизить расход фермента до концентрации

2-25 мкмоль, проводить процесс в более широком диапазоне рН (7,6-10,5) с получением стабильного высокого выхода целевого продукта.

Формула изобретения

l. Способ ферментативного получения пептидов общей формулы А-В, где А:N — концевой защищенный 1 аминокислотный остаток или пептидный остаток состава-2-6 L-аминокислот, содержащий L-аминокислоту на его

С-терминальном конце и необязательно защитную группу на N-терминальном конце, В:Ь вЂ” аминокислотный остаток, который может быть С-терминально защищен, путем взаимодействия аминокислотной и субстратной компонент в растворе в присутствии фермента, о т л и ч à to шийся тем, что, 1378785

Таблица 1

Синтез пептидов с катализацией карбоксипептидазой-У прн использовании свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты

Выход, Продукт

Глицин (3,0 М)

Алании (1,9 М)

Валин (0,6 M) 62

Bz-А3а-Gly-OÍ

Bz-Ala-OMe (55 мМ) 65

Bz-ALa-ALà-0Н

Bz-ALa-Val-OÍ (пример 1), Лейцин (0,17 М)

Фенилаланин (0,16 M) 24

Bz-ALa-Leu-ОН

Bz-ALa-Phe-0H

Серии (3,2 М) 50

Bz-АЬа-Ser-ОН

Треонил (0,7 М) Bz-ALa-Thr-0H

46

Метионин (0,6 М)

Лизин (1,5 М)

Аргинин (6,8 М) Bz-ALa-Met-ÎÍ

Bz-ALa,-Lys-OH

Bz-ALa-Arg-ÎH

Аспарагиновая кислота (1,0 M) Bz-ÀLa-Asp-OH с целью упрощения процесса,в качестве субстратной компоненты используют компоненту, выбранную из группы, содержащей сложные эфиры аминоки5 слот, сложные эфиры пептидов и депсипептидов формулы А-OR<, где значения А указаны выше, R — С, -С4-алкил, бензил или альфа-дезамино-фрагмент

01у, А1а или Рйе; амиды аминокислот или пептидов формулы А-NH, где значения А указаны выше, пептиды формулы А,-Х, где А, — L-аминокислота или ди-пентапептид, Х вЂ” L-аминокислота, а в качестве аминной компоненты используют компоненту, выбранную из группы, содержащей аминокислоты общей формулы Н-В-OFi, где значения В указаны выше, амиды необязательно

N-эамещенной аминокислоты формулы

Н-B-NFIR» где значения В указаны выше, R> — водород, оксигруппа, амино, С„-С -алкил, сложные эфиры аминокислоты формулы Н-В-OR, где значения В казаны выше P, — С -С -ал"Ф 4 кил, и процесс ведут в присутствии

L-специфического серии- или тиоалкилСубстрат (кон Аминовая компонента центрация) (концентрация) карбоксипептидазного энзима, который вводят в реакционную массу в концентрации от 2 до 25 мкмоль, процесс ведут в водном растворе или дисперсии при рН 7,6-10,5, 25-45 С при исходной концентрации субстратной компоненты 0,01-0,15 моль, аминной компоненты, 0,05-3,000 моль с последующим выделением необязательно saщищенного пептида, после чего в случае необходимости отщепляют группы

Б з или Н4 с помощью серинкарбоксипептидазного энзима.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве карбоксипентидаэногo энзима используют карбоксипептидазу-У иэ дрожжей, карбоксипептидаз СР-1-1 или СР-2-1 из проростков ячменя, 3. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что используют водный раствор, содержащий 0-207 органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из низшего алканола, диметилформамида или полиэтиленгликоля.

1378785

14

Продолжение табл. 1

Аспарагин (0,6 M) Hz-ALa-Авп-ОН

Глутаминовая кислота (1,2 М) Bz-ALa-Glu-OH

Изолейцин (0,15 М)

Глутамин (0,5 N) 40

Bz-А1а-Не-ОН

Bz-А1а-ОМе (50 мМ) Bz-А1а-Cln-OEI

0-трет-бутиловый эфир аспаргиновой кислоты (0,3 М) t

Hz-Ala-Аар/O p u/-ОН

Bz-Ala-Тгр-ОН

Триптофан (0,05 М)

Гистидин (1,0 M)

Валин (0 6 M) l0

Bz-Ala-His-OH

Z-Phe-OMe (55 мМ) Е-Phe-Val-OH

Z-Phe-Lys-OH

Лизин (3,0 М) (пример 2) 60

Bz-Phe-Gly-OMe (30 мМ) 40

Валин (0,6 M)

Глицин (2,0 М)

Алании (0,7 M).

Лейцин (0,15 М)

Лизин (1;5 М)

Глицин (2,0 М) Bz-Phe-Gly-.Val-ОН

Z-Аlа-ОМе (10 мМ) Е-Аlа-Gly-ОН

60

Е-Аlа-Ala-OH

Е-Ala-Leu-OH

Z-Ala-Lys-OH

Bz-Gly-Gly-ОН

63

Bz-01у-ÎMe (20 мМ) Ас-Phе-ОРt (50 мМ) Алании (0,8 М) Bz-Phe-А1а-ОН

Е-Ala--А1а- Глицин (2,0 М)

-ОМе (10 мМ) Z-А1а-Ala-Gly-OH

Е-Ala-Ala;-Leu-OH

Лейцин (0,15 М)

Фенилаланин (0,15 М)

Глицин (2,0 М) 0

Е-Al a-А1 à-Ph e-ОН

Z-Ala-Pne-Gly-ОН

Z-Аlа-Рйе

-ОМе (10 мМ) 35

Z-Аlа-Phe-Leu-OH

Лейцин (0,15 М)

Z-А1а-Heг—

-ОМе (10 мМ) Лейцин (0,15 М) Е-Ala-Бег-Leu-OH

Метиловый эфир глутаминовой кислоты (1,0 М) Bz-Аlа-Glu(OMe)-ОН

Продолжение табл,!

1378785

Лейцин (0,15 М)

Лизин (1,5 М)

Глицин (2,0 M)

Лейцин,0 15 М)

Глицин (2,0 M)

Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Vai-Сп-ОН

Z-ALa-Val-OMe (10 мИ) 60

Z-Ala-Va1-Lys-ОН

7.-Аlа-NLeu-Gly-ОН

Е-Аlа-I Theu-OMe (10 мМ) 16

Z-ALa-NLeu-Ieu-OH

Z-ALa,-Met-Gly-ОН

Z-Аlа-Met-OMe (10 мМ) 15

Z-ALa-Ме1-реп-ОН

Глицин (2,0 М) Z-Аlа-Tr p-ОМе (10 мИ) 23

Z-Ala-Trp-Gly-ОН

Лейцин (0,15 М) Z-Аlа-Trp-Leu-OH

Фенилаланин (0,15 М) Z-Ala-Trp-Phe-OH

Z-Ala-Trp-OMe (10 мИ) Лизин (1,5 M) 36

Z-A1à-Trp-Lys-ОН

Лейцин 0,15 М

Х-Аlа-Ala- Tyr-I.eu-OH

Z-Аlа-Аlа-Туг-OMe (10 мМ) Лизин (1,5 M )

Алании (1,7 М ) 23

Z-Ala-Ala- Tyr -Lós-OH

Z-Ala-Аlà- Tyr Àlà-OH

Таблица 2

Синтез пептидов при использовании аминокислотных амидов в качестве аминовой компоненты; катализатор — карбоксипептидаза-Х

Глицинамид (0,3 M)

Серинамид (0,3 М) 90

Bz-Ala-Gly-NH

Bz-Ala-Ser-NH а

Вz-Ala-Va1-NH

Bz-Ala-OMe (55 мМ) 90

Валинамид (0,4 М) (пример 4) 95"

Лейцинамид (0,3 М) Bz-Ala-Leu-NH

Ие ти онин амид (О, 6 M ) (пример 3) Bz-Ala«Met-NH

Фенилаланинамид (0,3 М) Bz-ALa-Phe-ИН

90"

Тироэинамид (0,6 М)

Аспарагинамид (0,3 М) 90

Bz-Ala-Туг-NH

Bz-Ala-As и-ИН

18

1378785

Пролинамид (0,3 М) 0

Bz-Ala.-Pro-NH г

Амид глутаминовой кислоты (0,25 М) Bz-Ala-Glu-ИН

88

97»

T-Phe-OMe (44 мМ) 60

64 J3z-Phe-01у-ОМе (30 мИ) Валинамид (0,4 М)

Валинамид (0,4 М) 90»

Е -Ph e-Al a,—,-ОМе (20 мМ) Глицинамид (0,4 М) 95

Z.,-Leu-Gly-Gly-ОЕт, (.0 мМ) Вк- Tyr -OÅt (50 мМ) 82

Z-Ala-OMe (10 мМ) 20

Bz-Arg- Tyr-NH а

Bz-Агд-OEt (75 мМ) 52

Валинамид (0,25 М)

Глицинамид (0,55 M) Bz- Tyr-OEt (50 мМ}

Вк- Tyr-Val-NH

Bz-Tyr-Gly-NH 2

Z-Pro-OMe (50 мИ) Z-Pro-Leu-NH

Bz-Gly-His-NH

"г

Ы-Gj у-ОМе (100 мМ) 20

Bz-Gly-Gly-NHq

Bz-Gly-Leu-NH

Z-Ala-Phe-Leu-NH z

К-Al a-Р1 е-OMe (10 мМ) Гистидинамид (О,? М)

В

Треонинамид (0,2 M) Валинамид (0,5 М)

Серинамид (0,4 М)

Тироэинамид (0,4 М) Гистидинамид (0,4 М) Валинамид (0,4 М)

Валинамид (0,25 М)

Глицинамид (О, 55 М)

Лейцинамид (0,15 M)

Глицинамид (0,15 М)

Тирозинамид (0,2 М) Лейцинамид (0,25 М)

Гистидинамид (0,2 М)

Глицинамид (О,SS М) Лейцинамид (0,25 М)

Лейцинамид (0,15 М) Продолжение табл. 2

Bz-Ala-His-NH>

Bz-Ala-Thr-NH

Z-Phe-Val-NH г

Е-Phe-Бег-NH

Z-Phe-Tyr-Инг

Bz-Phe-Gly-Val-NH

Д

Е-Phe-Ala-Val-NH

7.-Phe-Ala-Gly-NH

Z-Phe-Аlа-His-NH

Z-Leu-Gly-Gly-Val-NH 80

Bz-Гуг-Val-NH

Bz-Tyr-Gly-NH, Z-Ala-Leu-NH г

Z-ALa-Gly-NH>

1378785

П"одолжение табл 2

Глицинамид (0,15 Г1)

Глицинамид (0,15 M) Z-Ala-Phe-01у-ИН

Z-Ala-Ala-Cly-NH

100

Z-Ala-Aj a-ОМе (10 мМ) Лейцинамид 0,15 М) Z-Аlа-Ala-Leu-NH

100 (0,15 M) Z-Аlа-Ser- Лейцинамид

-ОМе (10 мМ) (0,15 М) 70

Глицин амид

Лейцинамид (0,15 M) Е-Ala-Val-OMe (10 мМ) 84

Глицинамид f0,15 И )

Лейцинамид (0,15 M)

Глицинамид (0,15 М) 100

Е-Ala-NLeu-Leu (10 мМ) 100

100

Z-Ala-Met-OMe (10 мМ) Z-Ala- 1et-Gly-NH

Е Ala-Trp-Gly-NH г

Z-Ala-Trp-Leu-NH г

Глицинамид (0,15 М) Глицинамид (0,15 М) 84

Е-Ala-Trp-ОМе (10 мМ) Лейцинамид (0,15 M) 89

Z-Thr-Pro-ОМе (25 мМ) Валинамид (0,2.М) Е-Thr-Pro-Val-NH

95

Глицинамид (0,15 М) Z-Ala-А" а-Tyr-ОМе (10 и) Z-Ala-Ala-Туг-01у-NH 100

Z-Аlа-Ala-Туг-Leu-NH 100

Лейцинамид (0,15 М) Z-Туг-Gly-Gly-0Me (20 мМ) Фенилаланинамид (0,2 М) Z-Туг-Gly-Gly-Phe-NH 40

" Продукт осаждался.

Таблица 3

Катализированный карбоксипептидазой-Х синтез пептидов с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компоненты

Продукт

Выход, Х

Br-Ala-ÑÌå Аланингидразид (0,6 M) Bz-Ala-Ala-NH-ИНд

Фенилаланингидразид (0,3 M) Bz-Ala-Phe-NH-NH

80!

Субстрат Аминовая компонента (концентра- (концентрация) ция) Е-Ala-Ser-Leu-NH

Z-Ala-Ser-Gly-NH

Л

Z-Ala-Val-Leu-NH

Z-Аlа-Val-Gly-ИН

Е-Ala-NLeu-Leu-NHq

Z-Ala-NLeu-Gly-ИН

l378785

Таблица 4

Катализированный карбоксипепсидазой-Y синтез пептидов с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты

Продукт

Выход, у иновая компонента (концентрация) Bz-Аlа-Gly-OH

Bz-Ala †G-Gly-OH

Глициноэтиловый эфир (0,5 М) Bz-Ala-ONe (50 мИ) 100

Глицинпропиловый эфир (0,5 М) Bz-Ala-Gly-OÍ

Глицинизопропиловый эфир (0,5 И) о0

Bz-Ala-Gly-OH

Глицинбутиловый эфир (0,5 И) Hz-Аlа-Gly-ОН

Лейцинметиловый эфир (0,5 М}

Вк-А1а-Leu-OH

Hz-Ala-Leu-Leu-OH

Лейцинэтиловый эфир (0,25 М) 50

Лейцин-t-бутиловый эфир (0,25 М) Hz-Аla-Leu-OH

Фенилаланинметиловый эфир (0,25 И) 80

Bz-Аlа-Phe-OH

Hz-Ala-Phe-Phe-ОН

Фенилаланинэтиловый эфир (0,15 М) 70

Bz-Ala-Glu(g-t,-Hu)-ОН 35

Hz-Ala-Glu (g -t,-Bu ) -ОН 0

Метионинметиловый эфир (0,2 И) 86

Иетионинэтиловый эфир (0,2 М) Bz-Ala-Met,-OÍ

Субстрат (концентрация) Метиловый эфир () -t-Bu) глутаминовой кислоты (0,5 И} (g-t-Вц) t-бутиловый эфир глутаминовой кислоты (0,25 М) Bz-А1а.-Leu-OH

Bz-Аlа-Leu-Leu-OH

Hz-Ala-Leu-Leu-Leu-ОН

Hz-Аlа-Leu-Leu-Leu-Leu-OH

Bz-Аlа-Phe-OH

Bz-Ala-Phe-Pne-0H

Bz-Ala-Phe-Phe-Phe-OH

Bz-Ala-Met-OÍ

Bz-АЪа-Met-Ме1-ОН

Bz-Ala-Met-Met-Met-OÍ

Bz-Ala-Met-Met-Met-Met-

-OH

1378785

24

Продолжение табл.4

Метионинизопропиловый эфир (0,2 И) Bz-Ala-Met-OH

Валинметиловый эфир

Bz-Аlа-Val-OH

Bz-Аlа-ЧаХ-Чаl-OH (0,7 М)

Серинметиловый эфир (0,5 М) 85

Bz-Ala-Ser-ОН

Тирозинметиловый эфир (0,5 М) 25

Bz-Ala-Туг-ОН

Аргининметиловый эфир (Й,5 М) Bz-Ala-Arg-ОН

Гистидинметиловый эфир (0,5 M) 26

Bz-Аlа-His-OH

Треонинметиловый эфир (0,5 М) 47

Bz-Аlа-Пп-ОН

Аланинметиловый эфир (0,5 И) Ас-Pne-Ala-OÍ

Ас-Phe-Ala-Ala-ON

Ас-Phe — OEt. (50 мИ) 60

Bz-Gly-ОИе (50 мМ) Т а б л и ц а 5

Катализированный карбоксипептидазой-У синтез пептидов с Ь- и Dизомерами в качестве аминовой компоненты

Субстрат Аминовая компонента (концентра- (концентрация) ция) Продукт

L-изо- D-изомер мер

Bz-Ala-OMe (50 мМ) Bz-Ala-Ual-OH

Bz-Ala Ala-OH

Bz-Туг-OEt (30 мМ) Bz-Tyr-Чаl-ОН

Bz-Туг-А1а-ОH

Bz-Ala-OMe (50 мИ)

Bz-Туг-OEt (30 мМ) Val-NHz (0,25 М) Bz-Ala-Val-NH

Val ИНд (0,25 М) 95 0

Bz-Туг-Val-NH

Ас-Ph e-Ala-OÍ

Ас-Phe-(Ala) -ОН

Ас-Phe-OEt (50 мМ) 60

Аlа-ОМе (0,5 M) Аргинин (NO>) метиловый эфир (0,5 И) Br-Ala-Агд(ИО )-ОН

Гистидинметиловый эфир Вк-Gly-His-ОН

Валин (0,6 М)

Алании (1,8 M)

Валин (0,6 M)

Алании (1,8 М) 42 0

65 0

30 0

46 0

78 0

1378785

Таблица 6

Выход (в l. ) в синтезе пептидов с использованием различных эфирных групп в качестве субстратных компонентов при катализе карбоксипептидазой-Y

Аминовая компонента

Субстрат

Bz-Gly-ONe Bz-Gly-OFt, Bz-Gly.-ORR Bz-Gly-OBll (20 мМ) (20 мМ) (20 мМ) (20 мМ) Глицин (2,0 М) 63

Глицинамид (0,15 М) 59

Лейцин (0,15 М) 21

74

Лейцинамид (0,15 М) 95

100

Таблица 7

Катализированный карбоксипептидаэол-Y синтез с депсипептидами в качестве субстратных компонент

Выход, 7

Продукт

Аминовая компонента (концентрация) 90

Bz-Glv -Gly-NH, Вк-61у-OGly (20 И) 95

Фенилаланинамид (0,25 М) 95

Вз-Gly-POhe (20 мМ) 95

Фенилаланинамид (0,25 М) 95

Bz-Phe-OGly (20 мИ) Bz-Phe-Leu-NH

Фенилаланинамид (0,25 М) 80

Bz-Gly-ОА1а Глицинамид (0,25 И) (20 мМ)

Амидлейцина (0,25 N) Bz-Gly-Leu-NH

Субстрат (концентрация ) Глицинамид (0,25 И)

Лейцинамид (0,25 М) Глицинамид (0,25 М)

Лейцинамид (0,25 М) Глицинамид (0,25 М)

Лейцинамид (0,25 М) Bz-Gly-Leu-NH z

Bz-Gly-Phe-NH

Bz-Gly-Gly-NH

Bz-Gly-Leu-МН

Bz-Gly-Phe-NH

Bz-Phe-Gly-ИН

Bz-Phe-Phe-NH z

Bz-Gly-Gly-МН

1378785

28

Таблица 8

Катализированчый карбоксипептидазой-Y синтез пептидов при использовании пептидов в качестве субстратов

Аминовая компонента (концентрация) Продукт

Выход, Х

Субстрат (концентрация}

Лейцинамид (0,25 M)

Лейцинамид (0,25 M) 90

Bz-Phe-Leu-NH

Bz-Gly-Leu-ННд

Bz-Phe-Gly

Bz-Gly-Phe (20 мМ) Е-Ala-Ala (20 мМ) 74

Z-Phe-Ala (20 MM) Лейцинамид (0,25 M) 60

Z-Phe-Leu-NH e

Z-Phe-Ser (20 мМ) Лейцинамид (0,25 М) 70

Z-Phe-Leu-ИН

Z-Ala-Gly (10 мМ) Лейцинамид (0,25 М) 80

7.-Ala-Leu-NH

Ас-(Ala) (1О мМ) Ас-(А1а) -Leu-NHë

Лейцинамид (0,25 М) 4 (10 MM) 70

Z-Аlа-Уае (10 М) 10

Z-Phe-Phe

-(10 М) 10

Таблица 9

Катализированный карбоксипептидаэой-Y синтез пептидов при разных значениях рн

Продукт

-Субстрат Аминовая компонента (концентра- (концентрация) ция ) рН

Выход, 7.

Bz-Ala-ONe (50 ММ) Глицин (1,3 М) Bz-Ala-Gly

Лейцинамид (Й,25 M) /-Аlа-Leu-ИН

Лейцинамид .(0,25 M) Ас-(Аlа) -Leu-ИН

Лейцинамид (О, 25 M) Z-Alа-Leu-NHz

Лейцинамид (0,25 М) Z-Phe-Leu-NH д

9,5 40

9,0 57

8,0 60

7,0 61

6,0 60

1378785

29

Продолжение табл.9

Глицинамид (1,3 М) Bz-Ala-Gly-И11

Таблица 10

Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов при различных аминокислотных производных в качестве аминовой компоненты

Аминовая компонента (концентрация) Субстрат (концентрация) Продукт

Ве Еход ф -Аланинамид (0,2 М) Bz-Ala-Ala-NH

Bz-Ala-ОМе (50 мМ) Глицингидроксаминовая кислота (0,2 М) Bz-Ala-Gly-NH-OH 75

D,L-аланингидроксаминовая кислота (0,2 М) Вк-Ala-Ala-NH-OH 50

Глицин " -метиламид (0t50 N) Bz-Ala-Gly-NH-СН 20

Таблица 11

Синтез пептидов с использованием карбоксипептидаз из проростков ячменя

CP-1-1 или СР-2-1

Фермент Выход, Я

Аминовая компонента Продукт (концентрация) Субстрат (концентрация) CP-1-1 43

Бк-Аla-Ча1-NH2

Bz--Ala-ONe (50 мМ) 58

CP-1-1

Bz-Ala-Ala-NH2

CP-1 — 1

Bz-Ala-Lys

Bz-А1а-Чаl-ИН2

CP-2-1 б4

CP-2-1

Bz-Аlа-Ala-NH

Bz-Ala-Lys

CP-2-1

Валинамид (0,25 М)

Аланинамид (0,25 М)

Лизин (1,7 М)

Валинамид (0,25 М)

Аланинамид (0,25 N)

Лизин (1,7 М) 5,0 51

9,5 77

9,0 95

8,0 !00

7,0 97

6,0 44

1378785

Продукт

Субстрат Аминовая компонента (концентра- (концентрация) ция) Выход, %

Ас-А1а-А1а-Ala-ONe (5O мМ) Ac-Ala-А1а-А1а-Leu-NH

Лейцинамид (0,15 М) 90

А1а-Ala-Ala-OMe (50 мМ) Лейцинамид (0,15 М) Ala-А1а-Ala-Leu » г

Таблица 13

Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов при использовании 50 мМ Bz-Ala-ОМе в качестве субстрата и свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты при наличии и отсутствии 20Х метанола (MeOH) в 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA

Выход, Е

Продукт

Аминовая компонента (концентрация) без МеОН с NeOH

Валин (0,6 М)

Треонин (1,2 M) 42 53

Bz-Ala-Val-OH

61

Bz-Ala-Thr-OH

Фенилаланин (0,16 M) Bz-Ala-Phe-OH

Лейцин (0,16 М)

Метионин (0,5 М)

Глицин (3,0 M)

Серии (3,2 М)

Лизин (1,5 M ) Bz-Ala-Leu-OH

Bz-Ala-Met-0H

64

Bz-Ala-01у-OY

55

Bz-Ala-Ser-ОН

41

Bz-Ala-Lys-OH

g -t-бутилэфир глутаминовой кислоты (1,0 M) Bz-Ala-Gly(g-OBut ) OH 54

Аспарагин (0,6 М) 14

Bz-Ala-Asu-OH

Таблица 12

Сравнение каталиэируемого карбоксипептидезой-Y синтеза пептидов при использовании в качестве субстратов пептидных эфиров с Л-концевыми защитными группами и без них

1 378785

Концентрация Выход, 7. треонина, M

PEG-300 в О, 1 M

КС1, 7

l0

0 7

0,7

0,35

Таблица 15

Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов из 50 мМ

Bz-Alа-01!е и указанных аминокислотных эфиров в качестве аминовой компоненты в ЗЖ-ном полиэтиленгликоле, О,! М КС1, 1 мМ EDTA

Другие условия: CPD-Y 8 мкМ; рН 9,6; 25 С

Аминовая компонента (концентрация) Продукт

Выход, Е

Валин-ОМе (0,5 М) Bz-Аlа-Val-OH

Bz-Ala-Val-Val-OH

Вк-Аlа-ОМе (50 мМ) Сарин-ОМе (0,5 М) 30

Hz-Ala,-Her-OH

Глутаминовая кислота ((-OBut)-OMe (0,5 М) Bz-Ala-Гlу-ÎH (овц )-он

Фенилаланин-ОМе (0,5 М) Bz-Аlа-Phe-ОЧ

Bz-А1а-Р1.е-Phe — OH

Hz-Аlа-Met-ОН

Bz-Ala-Met- Met-ОН

Ь-Метионин-ОМе (0,5 М) 85

Bz-А1а-Met,- iet-Met-OH

D-Метионин-ОМе (0,5 М) Bz-Ala.-D-Met-OH

Субстрат (концентрация ) Таблица 14

Катализированный карбоксипептидаэой-Y синтез

Hz-À1à-Thr-OH из Bz-Аlа-ОМе (50 мМ) и треонина при различных концентрациях полизтиленгликоля-300 (PEG-300). Условия: CPD-Y 4 мкМ; рН 9,6; 25 С

35

1378785

Таблица 16

Катализируемые нерастворимой карбоксипептидазой-Y синтезы пептидов

Выход, Х

Аминовая компонента Продукт (концентрация) Фенилаланин (0,15 М) Bz-A3.à-Phe

Bz-А1а-ОМе (50 мМ) Составитель В..Волкова

Редактор А.Огар Техред Л.Олийнык Корректор А, Обручар

Заказ 896/59 Тираж 348 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раунская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Субстрат (концентрация) Лейцинамид (0,2 M) Bz-А1а-Leu-NH., 91