Способ получения сульфатов пептидил-аргининальдегидов

Способ получения сульфатов пептидил-аргининальдегидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается производных пептидов, в частности получения сульфатов пептидил-аргининальдегида (СП). Цель - создание новых активных веществ пептидной природы с селективным торможением свертывания крови. Синтез СП общей ф-лы: ,,- -DPhe-Pro-A-H H,S04, где R, - Н; Rj - С,4 алкил; R и R присоединены к NH Tpynne D-фенилаланина; А - остаток L-аргинина, ведут конденсацией аргинин-лактама с защищенной гуанидиновой группой и защищенного по концевой аминогруппе дипептида N-моноалкил (С)-Ь-пролина. Полученный трипептидлактам восстанавливают до альдегида и после отщепления защитных групп вьщеляют целевой продукт в виде сульфатной соли. Выход, %: брутто-ф-ла: а) 75; 0,39-0,47; (-131)°; С х7/8 () 2,5(Н20); б) 70; 0,4- 0,5; нет; 5/6 (Н jSO ) х 3,5(Н20); в). 80; 0,64; нет; C2,H380,N,-H S04-4(); д) 67; 0,85- 0,7; нет. Новые СП проявляют антитромбиновую активность (в сравнении с контролем в пять раз увеличивается время свертывания), оказывают влияние на плазминфибриновую реакцию , стабильны во времени, а их минимально активная доза 1-2 мг/кг. 3 табл. § САЭ 00 и 1чЭ

СОВХОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИНЕСНИ Х

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТ У и

«(« а .

«

Фф У;

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3992296/23-04 (22) 20 ° 12.85 (31) 4763/84 (32) 21.12.84 (33) HU (46) 23.03. 88. Бюл, 1Ф 11 (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр

РТ (HU) (72) Шандор Байус, Эржебет Селл, Даниель Багди, Ева Барабаш, Марианн

Диосеги, Жужа Фиттлер, Ференц Йожа, Дьюла Хорват и Ева Томори (HU) (53) 547.964.4,07(088.8) (56) Шредер Э., Любке К, Пептиды, ч. 1, N. Мир, 1967, с. 116 ° (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТОВ

ПЕПТИДИЛ-АРГИНИНАПЬДЕГИДОВ (57) Изобретение касается производных пептидов, в частности получения сульфатов пептидил-аргининальдегида (СП). Цель — создание новых активных веществ пептидной природы с селективным торможением свертывания крови. Синтез СП общей ф-лы: R R—

-DPhe-Pro-А-Н.Н 80,, где R, — Н;

„„SU „„1384203 А 3 (51) 4 С 07 К 5/08 // A 61 К 37/02

R g — С -алкил; R 1 H R g присоедине ны к NH <-группе D-фенилаланина; А— остаток L-аргинина, ведут конденсацией аргинин-лактама с защищенной гуанидиновой группой и защищенного по концевой аминогруппе дипептида

N-моноалкил (С )-L-пролина, Полученный трипептидлактам восстанавливают до альдегида и после отщепления защитных групп выделяют целевой продукт в виде сульфатной соли.

6 о

Выход, %: R <, l d ) p брутто-ф-па:

a) 75; О, 39-0, 47; (-131) ; C НЯ 1«, х7/8 (Н S0 ) 2,5(Н О); б) 7; 0,40,5; нет; с, н 40 И 5/6(нgs04 ) " 3,5(HQO); в). 80; 0,64; нет;

С„Н„0,11,. Н,БО, 4 (Н,О); д) 67; О, 850,7; нет. Новые СП проявляют антитромбиновую активность (в сравнении с контролем в пять раз увеличивается время свертывания), оказывают влияние на плазминфибриновую реакцию, стабильны во времени, а их минимально активная доза 1-2 мг/кг.

3 табл.

1384203

Изобретение относится к способу получения сульфатов пептидил-альдегидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения — создание новых соединений пептидной природы, обладающих селективным торможением свертывания крови, но более ста бильных и не проявляющих склонности к необратимой циклизации.

R -значения определяют с помощью хроматографии в тонком слое на силикаг еле (Kieselgel G "Реанал", Будапешт) при применении в качестве элюирующего средства смеси растворителей. Этиловый эфир уксусной кислоты, пиридин, уксусная кислота и вода при соотношениях (960:20:6:11); (480:20:6:11); (240:20:6:11); (120:

:20:6:11); (60:20:6:11); (30:20:6:

:!1).

Пример 1. Сульфат Б-метил-D-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдегида °

Стадия 1. N-Бензилоксикарбонил-N-метил-D-фенилаланин-L-пролил-N—

-бензилоксикарбонил-L-аргинин-лактам.

42,95 r (0,11 моль) N-трет-бутилок сикарбонил-N -бензилок сикарбонил-L-аргинин-лактама суспендируют в 110 мл безводного хлороформа, пос" ле чего суспензию при перемешивании смешивают с 275 мл раствора хлористого водорода в этиловом эфире уксусной кислоты (концентрация О,ll0,15 г/мл), После перемешивания в течение 3 ч реакционную смесь разбавляют прибавлением 400 мл диэтилового эфира, выделившуюся в осадок кристаллическую массу отфильтровывают, два раза промывают осадок диэти-. ловым эфиром, применяя каждый раз по

100 мл последнего, а затем промывают два раза ацетоном, применяя каждый раз по 50 мл последнего. Затем продукт сушат в вакуумном эксикаторе над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия. После сушки приблизительно в течение 1 ч соединение растворяют в 100 мл диметилформамида, приготовленный раствор охлаждают до

-15 С, после чего при указанной температуре и при перемешивании прибав-, ляют в раствору сначала 20 мл, а затем 10-15 мл триэтиламина таким образом, чтобы в газовой фазе нельзя

Полученный маслообразный остаток растворяют в 60 мл смеси, состоящей иэ бензола и тетрагидрофурана (8:2), после чего раствор хроматографиру- ют на колонке, заполненной 750 r силикагеля-60, при применении в качестве элюирующего средства той же самой смеси растворителей. Фракции анализируют с помощью хроматографии в тонком слое на силикагеле при применении в качестве элюирующего средства смеси растворителей, состоящей было обнаружить перетекание основания. Ссупензию прибавляют к указанному ниже смешанному ангидриду.

50,9 г (0,1 моль) циклогексилам5 монийной соли N-бензилоксикарбонил-N-метил-D-фенилаланин-L-пролина растворяют в 200 мл диэтилового эфира и 120 мл 1 н. раствора серной кислоты. Фазу диэтилового эфира три раза промывают водой, применяя каждый раз по 30 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при

40 С и давлении 25-30 мбар. Полученный остаток и 11,2 мл (0,1 моль)

N-метилморфолина растворяют в 70 мл диметилформамида, раствор охлаждают до -15 С, после чего при указано

20 ной температуре смешивают с 13,2 мл (О, 1 моль) изобутилоксикарбонилхлорида. Затем (через 3-5 мин) смесь дополнительно перемешивают в течение 5 мин, после чего к полученному

25: смешанному альдегиду прибавляют указанную суспензию в диметилформамиде. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при — 15 С и в течение 1 ч при 0 С, затем смесь разбавляют прибавлением 200 мл бензола, после чего выделивашийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают.

Раствор продукта в бензоле и диметилформамиде разбавляют прибавле35 нием 150 мп воды, после чего производят разделение фаз. Нижнюю, содержащую воду,- диметилформамидную фазу три раза экстрагируют бензолом, применяя каждый раз по 50 мл последнего. Объединенные бензольные растворы три раза промывают водой, применяя каждый раз по 30 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной

45 бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 20-25 мбар.

1384203 из этилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды

480:20:6:11. Целевой продукт имеет

R --значение 0,70-0,76. Фракции, в которых содержится чистый основной продукт, объединяют и упаривают на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении

20-25 мбар до объема 100 мп. Полученный концентрат смешивают с 500 мл петролейного эфира. Образовавшуюся суспензию фильтруют, остаток на фильтре два раза промывают петролейэфиром, применяя каждый pR3

100 мл последнего, и затем сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и парафиновыми стружками.

Выход 45 г (65 ).(7 ", = +13,5 (c = 1, тетрагидрофуран). К „ =0,70- 20

0,76.

Вычислено, : С 65,08; Н 6,20;

N 12,31.

Сз Н 4 0 - И (682 ° 75)

Найдено„ : С 65,4; Н 6,4; 25

N 12,1.

Стадия 2. N-Бензилоксикарбонил-N-метил-D-фенилаланин-L-пролил-N—

-бензилокеикарбонил-L-аргининальдегид. 30

34, 15 r (0,05 моль) N-бензилоксикарбонил-N-метил-D-фенилаланин-LOJ

-пролил-N -бензилоксикарбонил-L-аргинин-лактама (пример 1, стадия 1) растворяют в 150 мл тетрагидрофурана, после чего приготовленный раствор при перемешивании смешивают с

0,0375 моль литийалюминийгидрида в тетрагидрофуране. Процесс восстановления контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в.качестве элюирующего средства смеси растворителей, состоящей из этилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 45

240:20:6:11, (R F — значения для лактама и альдегида составляют соответственно 0,8 0,5). В случае необходимости прибавляют дополнительное количество литийалюминийгидрида. 3атем при перемешивании и охлаждении

50 рН реакционного раствора доводят до значения 2 посредством прибавления 1 н. раствора серной кислоты.

Раствор разбавляют водой до появления опалесценции (приблизительно

300 мл), а затем два раза производят экстрагирование гексаном, применяя каждый pas по 100 мл последнего. Содержащий воду, тетрагидрофурановый раствор два раза экстрагируют при применении 250 мл метиленхлорида, объединенные метиленхлоридные экстракты последовательно промывают два раза водой, применяя каждый раз по 50 мл последней, два.раза 5 -ным раствором кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 60 мл этого раствора, и вновь два раза водой, применяя каждый раз по 50 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 20-25 мбар до объема 50-60 мл.

Остаток смешивают со 100 мл бензола, а затем упаривают описанным способом. Полученный остаток разбавляют прибавлением 100 мл циклогексана, образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают два раза циклогексаном, применяя каждый раэ по 30 мл .последнего, а затем сушат в вакуумэксикаторе над парафиновыми стружками.

Выход 27 r (70 ) продукта, кото1 рый в соответствии с данными элементного анализа, содержит 1 моль циклогексана. R = 0,52-0,62. (Ы)з,= +16,.8 (с = 1, тетрагидрофуран) .

Вычислено, : С 67,16; Н 7,34;

N 10,93.

С „H «O,N «H,z (768,93)

Найдено, : С 66,6; Н 7,2;

N 10,4.

Стадия 3. .Сульфат N-метил-D-фенилаланин-Ь-пролил-L-аргининальдегида.

23,1 r (0,03 моль) N-бензилоксикарбонил-N-метил-D-фенилаланин-L6)

-пролил-N -бензилоксикарбонил-L-ар- . гининальдегида (пример 1, стадия 2) растворяют в 150 мл этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 50 мл обессоленной нонированием воды, 48 мл 1 н. раствора серной кислоты и 3 r 10X-ного палладия на угле, применного в качестве катализатора, и производят гидрирование., Процесс гидрирования контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в качестве элюирующего средства с.1 си растворителей, состоящей иэ эт ;чового эфира уксусной кислоты, пир цина, уксусной кислоты и воды в ыотношении

1384203

20

30: 20:Ь:11 (R < — значения исходного соединения 0,9, промежуточного продукта 0,7 и конечного продукта 0,4).

После завершения реакции катализа5 тор отфильтровывают и промывают его три раза обессоленной ионизированием водой, применяя каждый раз по 30 мл последней. Объединенные фильтрат и полученную при промывке жидкость упаривают на роторном испарителе до объема 100 мл. Водный остаток разбавляют обессоленной ионированием водой приблизительно до 200 мл. Если значение рН не находится в пределах между 6,0 и 6,5, то его приводят к этому пределу посредством прибавления О,1 н. раствора серной кислоты, ионообменника в ОН-форме (например, AG IX8). Непосредственно после этого осуществляют лиофилизацию.

Выход 12,4 г (75%) . К = 0,390,47. 43, = -131 (с = 1, вода).

Вычислено, %: С 46,07; H 7,13;

N 15,35; S 5,12.

Сg,Н Оз1Яь 7/8 (Н2$0 ) 2,5 (Н20) (547,37)

Найдено, %: С 46,4; Н 7,2;

N 15,05; $ 5,0.

Исходные вещества получают следующим образом, N-Бензилоксикарбонил-N-метил-Dфенилаланин-L-пролин.

Стадия А. 2,4,5-Трихлорфениловый эфир бензилоксикарбонил-Э-фенилаланина.

60,0 r (0,2 моль) бензилоксикарбонил-Р-фенилаланина и 39,4 г (0,2 моль) 2,4,5-трихлорфенола раст- 40 воряют в 200 мл тетрагидрофурана, раствор охлаждают до 5-10 С, после чего охлажденный раствор при переме шивании смешивают приблизительно в течение 30 мин с 41,2 г (0,2 моль) 4,.

45 дициклогексилкарбодиимида, затем реакционную смесь перемешивают в течение 6 ч без охлаждения. Выделившийся в осадок дициклогексилкарбамид отфильтровывают, три раза промывают его тетрагидрофураном, применяя каждый раз по 50 мл последнего, и объединенные тетрагидрофурановые растворы упаривают в вакууме.

Полученный остаток перекристаллизовывают из горячего этилового спирта, кристаллический продукт отфильтровывают, два раза прЬмывают при 5-10ОС этиловым спиртом, применяя каждый раз по 50 мл последнего, и сушат в вакуум-э ксикаторе.

Выход 72 г (75%), т. пл. 139141 С, Гс 1, = +37 (с = 1, диметилформамид).

Вычислено, %: С 57,70; H 3,79;

N 2,92; Cl 22,22.

С >Н,З О МС1) (478,75)

Найдено, %: С 57 7; Н 3 9;

N ЗФОУ С1 22929

Стадия В. Бензилоксикарбонил-D-фенилаланин-L-пролин.

71,8 г (0,15 моль) 2,4,5-трихлорфенилового эфира бензилоксикарбонил-D-фенилаланина (пример 1, стадия А) растворяют при перемешивании и комнатной температуре в 180 мл безводного пиридина, а затем приготовленный раствор смешивают с 17,3 г (0,15 моль) L-пролина и 21,0 мл (0,15 моль)триэтиламина. Перемешивание продолжают до полного растворе-. ния L-пролина. Затем реакционную смесь выдерживают в течение 4-6 ч, непосредственно после этого ее упаривают до объема 80-100 мл на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 1320 мбар, после чего остаток смешивают с 250 мл воды и 90 мл диэтилового эфира. Водную фазу два раза экстрагируют диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 30 мл последнего, объединенные эфирные растворы два раза промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 30 мл этого раствора, а затем объединенные водные растворы подкисляют до рН 2 посредством прибавления 3 н. раствора соляной кислоты. Выделившееся в осадок маслообразное вещество три раза экстрагируют зтиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз .по

120 мл последнего, объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты три раза промывают водой, применяя каждый раз по 40 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане до 50-100 мл при температуре, составляющей максимум

40 С, и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток перекристаллизовыва-. ют из 200 мл диэтилового эфира.

Ю

Кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по

1384203

40 мл последнего, и сушат на воздухе.

Выход 50,4. r (85 ). T. пл. 132133 С.(7 = -46,4 (с = 2, диметилформамид), К = 0,5.

Вычислено, : С 66,65;. H 6,10;

N 7,07

Сг,Нг О М (396,43)

Найдено, .: С 66,4; Н 6,25, !О

N 7,2.

Стадия С. Циклогексиламмонийная соль N-бензилоксикарбонил-N-метил-D-фенилаланин-L-пролина.

39,6 r (0,1 моль) бензилоксикар.бонил-D-фенилаланин-Ь-пролина (пример 1, стадия В) и 50 мл (0,8 моль) иодистого метила растворяют в 300 мл безводного тетрагидрофурана. Пригоо товленный раствор охлаждают до 0 С, 20 после чего при перемешивании при-. бавляют к нему порциями 13,2 г (0,3 моль) гидрида натрия, причем количество порций составляет 8-10, затем перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение 2 ч.

Непосредственно после этого к реакционной смеси прибавляют 500 мл этилового эфира уксусной кислоты с целью разложения образовавшейся гидроокиси натрия, и дополнительно осторожно прибавляют еще 10 мл воды для разложения избыточного количества гидрида натрия, Затем раствор упаривают на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 15-20 мбар, Остаток растворяют в 250 мл воды и 100 мл диэтилового эфира, водную фазу промывают 100 мл диэтилового эфира, после чего объединенные эфирные растворы промывают

50 мл 5 -ного раствора кислого углекислого натрия. Раствор кислогб углекислого натрия и водную фазу объе-. диняют, подкисляют прибавлением 5 н. раствора сернокислого калия до рН 2, а затем два раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 150 мл последнего °

Объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты по .. следовательно промывают 100 мл воды, 50 мл 10 -ного раствора тиосульфата натрия, повторно 100 мл воды, сушат органическую фазу над безводным сер-. нокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давле-. нии 15-20 мбар. Полученный остаток растворяют в 600 мл бензола, раствор смешивают с 12 мл (0,105 моль) циклогексиламина, после чего смесь выдерживают в течение ночи при комнатной температуре, Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают бензолом, применяя каждый раз по 200 мл последнего, и затем сушат в вакуумэксикаторе над парафиновыми стружками, Выход 38,2 r (75 ) . R„= 0,530,60 (циклогексиламин 0,01-0,05), Т. пл. 160-163 С. Г«7 = +12, 1 (с = 1, метиловый спирт), Вычислено, : С 68,34; Н 7,71;

N 8,25.

С Н О .И С Н,qN (509,63) .

Найдено, : С 68,5; Н 7,8;

N 8,3.

Ы (О

N -трет-Бутилоксикарбонил-N -бензилоксикарбонил-L-аргинин-лактам.

Стадия Д. Гидрат N -трет-бутилокd сикарбонил-И -бензилоксикарбонил-Lаргинина, 65,8 г (0,2 моль) гидрата хлоргидрата трет-бутилоксикарбонил-Ь-аргинина растворяют в 100 мл 4 н. раствора. гидроокиси натрия, приготовленный раствор охлаждают до 510 С, затем при перемешивании его смешивают с 80 мл (0,5 моль) бензилоксикарбонилхлорида и с 150 мл 4 н. раствора гидроокиси натрия так, чтобы значение рН раствора было выше

12. Непосредственно после этого ре акционную смесь дополнительно перемешивают в течение 3-4 ч, затем разбавляют ее прибавлением 150 мл воды, после чего производят экстрагирование 100 мл диэтилового эфира. Образовывалось три фазы. Две нижние фазы еще два раза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по

100 мл последнего, смешивают с 300400 мл метилового спирта для того, чтобы гомогенизировать фазы, после чего значение рН раствора, если необходимо, доводят до 12 (прибавлением 4 н. раствора гидроокиси натрия) . Раствор выдерживают в течение

6-8 ч, а затем его два раза экстрагируют смесью диэтилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфира, взятых в соотношении 1:1, значение рН прибавлением ледяной уксусной кислоты доводят до 6-7 (приблизительно 50 мл), три раза производят

1384203 экстрагирование хлористым метиленом, применяя каждый раз по 140 мл последнего, Растворы продукта в хлористом метилене объединяют, два раза промывают водой, применяя каждый раз по 60 мл последней, а затем упаривают на водяной бане при 40 С и дав- . лении 25-30 мбар, Полученный остаток смешивают с 300 мл бензола и,600 мл воды, смесь в течение 2-3 ч перемешивают при 20 С, затем выдерживают в течение ночи при 10 С. Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, промывают последовательно 300 мл воды и 300 мл бензола, после чего сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора и дарафиновыми стружками.

Выход 60 r (70X) . Т. пл. 122124 Се (d3 д = 20 7 (c =. 1, пири дин) .

Вычислено, 7.: С 53,51; Н 7,09;

N 13,14.

С „Н „О, 1 „Н,О (426, 46)

Найдено, X С 53 35; H 7,2;

N 13,1.

Стадия Е. N -трет-Бутилоксикарбонил-Ф-бензилоксикарбонил-L-аргинин-.

30 лактам.

59,7 r (0,14 мбль) гидрата N —-трет-бутилоксикарбонил-N -бензилоксикарбонил-L-аргинина (пример 1, . стадия Д) и 19,6 г (0,14 моль) триэтиламина растворяют в 200 мл тетрагидрофурана. Приготовленный раствор охлаждают до — 10 С, после чего при укаэанной температуре и при перемешивании его смешивают сначала с

18,5 мл (0,14 моль) изобутилокси40 карбонилхлорида, а затем через

l0 мин с -19,6 мл (0,14 моль) три,этиламина. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при 0 С и еще в течение 1 ч без охлаждения, причем после завершения перемешивания смесь выливают в 1 л ледяной воды. Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, два.раза промывают его ледяной во- 50 дой, применяя каждый раз по 100 мл последней, и непосредственно после этого растворяют в 280 мл хлороформа.

Хлороформный раствор промывают

100 мл ледяной воды, сушат над без- 55 водным кальцием и при температуре максимум 40 С и давлении 20-25 мбар упаривают .на водяной бане. Кристал-, лический остаток суспендируют в

70 мл петролейного эфира, продукт отфильтровывают, два раза промывают петролейным эфиром, применяя каждый раз по 30 мл последнего, и сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора.

Выход 44 г (81X). Т пл. 164166 С. td 3 g = -24 (с = 1, тетрагидрофуран).

Вычислено, X: С 58,44; Н 6,71;

N 14,45.

С,9Н О И (390,43)

Найдено, X: С 587; Н 68;

N 14,1.

Пример 2. Сульфат N-этил-D-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдегида.

Стадия 1. N-Бензилоксикарбонил(и

-N-этил-D-фенилаланин-L-пролил-N—

-бензилоксикарбонил-L-аргинин-лактам.

2, 1 r (О, 005 моль) N-бензилоксикарбонил-N-этил-D-фенилаланин-L-npo лина и 2,15 r (0,0055 моль) N -третс .-бутилоксикарбонил-N -бензилоксикарбонил-L-аргинин-лактама (пример 1, стадия Е) вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации (по способу, описанному в примере 1, стадия 1), при применении пропорциональных количеств реагента и растворителей. При обработке реакционной смеси и во время хроматографии на колонке фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое .при при-. менении в качестве элюирующего средства смеси бензола и толуола (8:2).

Фракции, которые содержат чистый основной продукт (R = 0,4-0,5), объединяют, упаривают на водяной бане . при температуре 40 С и давлении 1520 мбар, остаток обрабатывают диизопропиловым эфиром, отфильтровывают, промывают диизопропиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и парафиновыми стружками.

Выход 1,9 r (547). В. = 0,750,85.

Стадия 2. N-БензилоксикарбонилN-этил-D-фенилаланин-L-пролил-N —

-бензилоксикарбонил-Ь-аргининальдегид. .1,4 г (0,02 моль) N-бензилоксикарбонил-N-этил-П-фенилаланин-L-пролил-N -бензилоксикарбонил-L-аргинин(d лактама (пример 2, стадия 1) вводят во взаимодействие аналогично приме1384203

12 ру 1, стадия 2, при применении пропорциональных количеств реагентов.

Выход 1,15 г (72 ) продукта, который в соответствии,с данными элементного анализа содержит 1 моль циклогексана. R„ = 0,55-0,65. з

Вычислено, : С 67,49; Н 7,47;

N 10,73.

C q H

Найдено, : С 67,6; Н 7,5;

N 10,5.

Стадия 3. Сульфат N-этил-D-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдегида.

0,78 г (0,,001 моль) N-бензилоксикарбонил-N-этил-D-фенилаланин-L-пролил-N -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальдегида (пример 2, стадия 2) вводят во взаимодействие аналогично примеру 1, стадия 3, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей, Выход О, 75 г (70 ) . R = 0,4-0, 5.

Вычислено, %: С 45 93; Н 7,48, N 14,61; S 4,64.

CgaHgy0gNg. 5/6 (Н $0„) 3,5 (HP) (575,27) .

Найдено, : С 46,1; Н 7,6;

11 14,2;. S 4,6.

Исходное соединение, а именно

N-бензилоксикарбонил-N-этил-D-фенилаланин-L-пролин, может быть получено следующим образом, Стадия А, N-этил-D-фенилаланин.

8,25 r (0,05 моль) D-фенилаланина растворяют в 100 мл 20 .-ного водного этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 5,65 мл (0,1 моль) уксусного альдегида и

2 г 10 -ного палладия на угле, примененного в качестве катализатора, после чего в течение 2 дн. производят гидрирование. Затем катализатор отфильтровывают, промывают его 60 мл

2 н, раствора соляной кислоты, после чего рН водного раствора доводят до значения 7 посредством прибавле.ния 4 н. раствора гидроокиси натрия.

Выделившийся в осадок продукт отфильтровывают, три раза промывают, I водой, применяя каждый раз по 20 мл последней, и сушат в вакуум-эксикаторе над безводным хлористым кальцием °

Выход 4,85 г (50 ) (о ),= -53 (c = 1, 0,1 н. раствор гидроокиси натрия), Вычислено, : С 68 37; Н 7,82;

N 7,25.

С, Н <N (193 24)

Найдено, : С 68,5; Н 7,65

N 7,2, Стадия В. N-Бензилоксикарбонил-N-этил-D-фенилаланин.

2,9 г (О 015 моль) N-этил-В-фенилаланина (пример 2, стадия А) растворяют в 22,5 мл 2 н. раствора гидроокиси натрия. Приготовленный раствор смешивают сначала с 10 мл диок1 сана, а затем после охлаждения до

5-10 С с 2,5 мл (приблизительно

0,017 моль) бензилоксикарбонилхлори15 да, после чего реакционную смесь перемешивают при охлаждении в течение

3 ч. После этого реакционную смесь разбавляют прибавлением 40 мл воды, а затем производят экстрагирование

20 30 мл смеси, состоящей из диэтилового эфира и петролейного эфира в соотношении 1:1. В результате получают трехфазную систему. Две нижние фазы вновь экстрагируют 300 мл ди25 этилового эфира, и объединенные водные фазы подкисляют 1 н. раствором серной кислоты (рН 2). Выделившийся в осадок продукт три раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 30 мл последнего. Растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты объединяют, два раза промывают водой, которую каждый раз берут в количестве

20 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают затем на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении

15-20 мбар.

Выход 2,7 г (55 ) маслообразного продукта. Кр = 0,5-0,6.

Стадия С. N-бензилоксикарбонил-N-этил-D-фенилаланин-L-пролин.

2,6 г (0,008 моль) N-бензилокси45

- .карб анильо-этил-D-фенилаланина (пример 2, стадия 2) растворяют в 10 мл тетрагидрофурана. Приготовленный раствор при О С смешивают с 1,6 г (0,008 моль) 2,4,5-трихлорфенола и

1,65 г (0,008 моль) дициклогексилкарбодиимида, после чего реакционную смесь выдерживают в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь фильтруют и фильтрат упаривают на водяной бане при о температуре максимум 40 С и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток растворяют в 40 мл бензола, раствор промывают два раза 5 -ным растворам

1384203

14

30 кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 20 мл этого раствора, и два раза водой, которую каждый раз берут в количестве 20 мл. Непосредственно после этого раствор сушат

5 над сернокислым натрием и затем упаривают на водяной бане при температуре максимум 40 С и давлении 15-

20 мбар. Маслообразный остаток растворяют в 10 мп пиридина, раствор смешивают сначала с 0,92 г (0,008 моль) L-пролина, затем с

1,12 мл (0,008 моль) триэтиламина,. после чего реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре ро полного растворения L-пролина. Раст1" вор выдерживают в течение 4-5 ч и непосредственно после этого упаривают на водяной бане при температуре максимум 40 С и давлении 1520 мбар. Полученный остаток растворяют в 25 мл воды и 10 мл диэтилового эфира, водную фазу два раза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по .10 мл последнего, аЯ объединенные эфирные растворы два раза промывают 5 -ным раствором кислого углекислого натрия, причем каждый раз применяют по 10 мл этого раствора. Объединенные водные фазы подкисляют до рН 2 посредством прибавления 3 н. раствора соляной кислоты. Выделившийся в осадок продукт три раза экстрагируют бензолом, применяя каждый раз по 15 мл последне.го, объединенные бензольные экстракты трижды промывают водой, которую всякий раз берут в количестве 5 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и затем упаривают на водяной

40 бане при 40 С и давлении 15-20 мбар.

Выход 2,2 r (64 ) маслообразного продукта. R„= 0,5-0,6.

Пример 3. Сульфат N-изобутил-D-фенилаланин-L-пролил-L-арги45 нинальдегида.

Стадия 1. N-Бензилоксикарбонил-N-изобутил-D-фенилаланин-L-пролил-Ы -бензилоксикарбонил-L-аргининлактам.

2,26 г (О 005 моль) N-бензилок-: сикарбонил-N-изобутил-D-фенилаланин-L-пролина и N -трет-бутил-оксикарбонил-N -бензилоксикарбонил-L-аргинин-лактама (пример 1, стадия Е) 55 вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации аналогично примеру 1, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

При обработке реакционной смеси и в процессе хроматографии на колонке фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое в смеси растворителей, состоящей из этилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 480:20:6:11, и фракции, которые содержат чистый продукт с R = О;75-0,85, объединяют. Затем эти фракции упаривают на о водяной бане при 40 С и при давлении 15-20 мбар, полученный остаток обрабатывают петролейным эфиром, отфильтровывают, .продукт промывают петролейным эфиром и сушат в вакуумэксикаторе над парафиновыми стружками.

Выход 2,7 r (75 ). RF =0,75-0,85. (a 3 р = -5,8 (с = 1, тетрагидрофуран) .

Вычислено, %: С 66, 30 Н б, 95

N 10 87.

С оН 80 У а 2/3 (С4НрО) (772,90)

Найдено, : С 65,0; Н 6,8;

N 10,80.

Стадия 2. N-бензилоксикарбонил-N-изобутил-В-фенилаланин-L-пролил(0

-N -бензилоксикарбонил-L-аргининальдегид.

1,45 г (0,002 моль) N-бензилоксикарбонил-N-изобутил-D-фенилаланин-L-пролил-N -бензилоксикарбонил-? " аргинин"лактама (пример 3, стадия 1) восстанавливают аналогично примеру

1, стадия 2, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 1,О r (62 ). R = 0,24. о о (Ы7 = +2,3 (с =,1, тетрагидрофуран) .

Вычислено, %: С 66,64; Н 7,149

N l1,24.

С4о Н 0>N g /4 (С Н, ) (747,89)

Найдено, : С 66,3; Н 7,1;

N 11,2.

Стадия 3. Сульфат N-изобутил-D"фенилаланин-L-пролил-L-аргининаль- де гида.

О, 81 r (О, О О l моль) N-б ен зилокси-. карбонил-N-изобутил-D"ôåíèëàëàíèí-L-пролил-И -бензилоксикарбонил-Ltd аргининальдегида (пример 3, стадия 2) вводят во взаимодействие аналогично примеру 1, стадия 3, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.

Выход 0,45 r (80 ), R p 0,64.!

384203

Вычислено, %: С 45,.84; Н 7,69;

N 13» S 5,1.

C)qH 0 Nq H S04 4 (Н О) (628,74)

Найдено, X: С 45,8; Н 7,2;

N 13,4; S 4,9.

Исходное соединение, а именно

N-бензилоксикарбонил-N-изобутил-D-фенилаланин-L-пролин, может быть получено следующим образом, Стадия А. N-Иэобутил-D-фенилаланин.

В качестве исходного вещества применяют 8,25 г (0,05 моль) D-@e" нилаланина и осуществляют способ аналогично примеру 2, стадия А, с тем отличием, что вместо уксусного альдегида применяют 9,1 мл (0,1 моль) изомасляного альдегида °

Выход 8,7 г (70X), Г 3 в = -29,9 (с = 1, 0,1 н. раствор гидроокиси натрия).

Вычислено, %: С 67,79; Н 8,75;

N 6,08.

С H <>0

Найдено, %: С 67,2; Н 8,9;

6,15.

Стадия В, N-Бензилоксикарбонил-N-изобутил-D-фенилаланин.

3,32 г (0,015 моль) N-изобутил-Э-фенилаланина (пример 3, стадия А) вводят во взаимодействие аналогично примеру 2, стадия В, Выход 3,2 г (60%) маслообразного продукта. R = 0,6"0,7. 1 =

Стадия С. N-Бензилоксикарбонил-N-изобутил-D-фенилаланин-Ь-пролин.

2,85 г (0,008 моль) N-бензилоксикарбонил-N-иэобутил-D-фенилаланина

40 (пример 3, стадия В) вводят во взаимодействие аналогично примеру 2, стадия С;

Выход 2,45 r (67X) маслообразного продукта, R = 0,65-0,70.

Проводят биологические испытания производных пептидил-аргининальдегидов, полученных в условиях предлагаемого способа.

При проведении специальных исследований пептиды растворяют в воде (рН 6,0) в концентрациях 10 мг/см после чего растворы хранят при 40 С.

В течение 5 дн. наблюдают за изменением антитромбиновой активности растворенного вещества. Характеризующее активность значение определя" ют в системе, которая состояла иэ следующих составных частей, см

0,5%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли 0,2; буферный раствор, содержащий трис-(оксиметил)-аминометан и хлористый водород (значение рН 7,2), который также содержит раствор исследуемого пептида, 0,3;

5 ед./см раствора US Standard Human

Thrombin (NIH, Бетезда, Мэриленд, США), 0,1.

Время свертывания этой системы без добавки пептида составляло в приборе Schnither Gross Coagulomefer

l5 с.

Начальную тормозящую свертывание крови активность отдельных сульфатов трипептид-альдегидов обозначают такой молярной концентрацией, которая в сравнении с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания (1 ;значение).

Измеренные на первые, третьи и пятые сутки антитромбиновой активности отдельных пептидов в водном растворе при рН 6,0 и 40 С от начальной активности (нулевые сутки) и приведены в табл. 1.

В течение периода наблюдения на" чальная активность сульфата D-фенилаланин-L-пролил-. L-аргининальдегида уменьшается в два раза, в то время как N-метильное производное сохраняет свою первоначальную активность, а активность N-этильного и N-иэобутильного соединений уменьшается лишь на 15-20%, В условиях проведения

1 опытов следует считаться с частичной рецемизацией находящегося на конце молекулы L-аргининальдегида.

Именно этим может быть объяснено незначительное падение активности

N-этильного или N-изобутильного про изводного, Действие N-алкилтрипептидальдегидов на плазминфибриновую реакцию также исследуют и определяют на примере сульфата N"ìåòèë-D-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдегида в следующей системе, см : 0,05%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли

0,2; содержащего трис-(оксиметил)аминометан и хлористый водород буферного раствора (значение рН 7,2) который также содержит исследуемый пептид 0,1; раствор US Standard

Human Thrombin (NIH) Бетеэда, Мэриленд, ClllA/ 10 ед,/см 0,1; 0,1 ед.

1384203

l7

18 плазмина в 0,1 мл буферного раствора (KABI, Стокгольм, !!1веция).

Время свертывания образовавшегося в системе фибринозного геля без добавления пептида 10 мин.

В качестве .контрольного соединения применяют сульфат D-фенилала нин-L-пролил-Ь-аргининальдегида, а также гемисульфат трет-бутилоксикарбонил-П-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдегида.

Действие трипептидальдегидов на плаэминфибриновую реакцию показано в табл. 2 (время растворения фибринозных сгустков без добавления пептида 10 мин).

Иэ приведенных в табл. 2 данных видно, что N-алкилированный трипептидальдегид ведет себя как известный, содержащий свободную расположенную на конце аминогруппу. При ма" лых количествах образовавшиеся сгустки растворяются в течение контрольного времени, при больших количествах сгустки либо вообще не образуются, либо образуются со слабой гелевой структурой. Одновременно гемисульфат ацилтрипептидальдегида в зависимости от концентрации удлиняет время гидролиза плазмина фибринозных сгустков.

Из описанных исследований следует, что новые трипептидальдегиды с алкилированными концевыми аминогруп пами обладают. значительно большей

l стабильностью чем известный сульУ фат D-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдегида, но одновременно они представляют собой аналогичные се" лективные замедлители свертывания, поскольку они не оказывают влияния на плазминфибриновую реакцию.

Новые N-алкилтрипептидальдегиды предлагаемой формулы обладают in ч vo значительной тормозящей свертывание крови активностью. При проведе" нии исследований пептиды вводят внутрь через рот или внутривенно новозеландским зайцам (вес 2-3 кг), причем пептиды вводят в физиологическом растворе соли. При внутривенном введении, в течение 3 ч вливания с дозами 0 5-2,0 мг/кг/ч введения производят со скоростью 6 мл/ч.

Через рот вводят внутрь 20-30 мг/кг пептида, растворенного в объеме ,2 мл. После введения с интервалами в 30 мин из каудальной вены отбирают пробы крови, после чего в тромбоэластографе определяют время свертывания всей крови, одновременно также измеряют время плазма-тромбиновой реакции °

Тормозящее свертывание в живом организме действие. М"алкилтрипептидальдегидов в опытах на самцах ново" зеландского зайца показано в табл. 3.

Приведенные в табл. 3 данные показывают, что М-алкилтрипептидаль" дегиды обладают равной или близкой активностью по сравнению с веществом, примененным для сравнения.

На основании исследований по внутривенному вливанию, осуществленных на зайцах, установлена доза для человека при внутривенном введении, составляющая 1-2 мг/кг/ч.

Проведенные испытания показывают, что N-алкильные (С„-С4)-производные сульфатов пептидилальдегидов в течение периода наблюдения не" значительно теряют свою первоначальную активность (N-этильные и N-изо" бутильные производные теряют активность на 15-20 ), в то время как соединение сравнения деэактивирует30 ся за этот период íà 60 .

Кроме того, новые трипептидальде" гиды с алкилированными концевыми аминогруппами более стабильны, чем известный сульфат D-фенилаланин-1.пролил-L-аргининальдегида, но одно35 временно они представляют собой ана" логичные селективные эамедлители свертывания, поскольку при эффективном торможении тромбин-фибриногено" вой реакции они не оказывают влия40 HHH на плазминфибриновую реакцию.

Формула изобретения

Способ получения сульфатов пеп45 тидил-аргининальдегидов общей формулы

Б, А.-H Н ЯО

50 2 где R „" водород;

R < - С,-С "алкил, причем R „и R< присоединены к аминогруппе

D"ôåíèëàëàíèHà; сг

А " остаток Ь-аргинина, отличающийся тем, что аргинин-лактам с защищенной гуанидиновой группой конденсируют с эащи"

1384203

19 щенным ло концевой аминогруппе дипептидом N".ìîíîàëêèë(С„ -С )-L-пролином, полученный защищенный трипептидлактам восстанавливают до соотТаблиц а 1

Активность, Ж, через сутки

Начальная

Пептидальдегид активность, 7о

1 ео О-е р М сут

1-е

3-и 5-е

0,25 100 100 100 100 гида

Сульфат N-этил-D-фенилаланин-L-пролил"

-L-аргининальдегида 0,21 100 100

100 85

0,31 100 100

85 80

0,35 100 100

40

Концентрация пептида в реакционной смеси (pM), которая в сравнении с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания.

Таблица 2

О,!8

Сульфат N-метил-Р-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдегида

0,36

0,72 Нет сгустков

Сульфат N-метил-D-фенилаланин-L-пролил-L-аргининальдеСульфат N-изобутил-D-фенилалан