Способ определения l-аминокислот
Иллюстрации
Показать всеРеферат
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
Ai (19) (11) (su 4 G 01 N 27 46 С 12 P 13/04
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А8ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Egg,у, (21) 4120397/31-13 (22) 02.07,86 (46) 07 ° 04.88. Бюл. Ф 13 (71) Институт биохимии AH ЛитССР (72) Ю. Ю. Кулис, M. В. Песлякене и .В.-С.А. Лауринавичюс (53) 663.15(088.8) (56) White W. G., Guilbault G. G.
Lysine specific enzyme electrode
for determination of Lysine in
Grains and Foodstuffs. — Anal. Chem, 1978, v. 50, р. 1481-14, Ianiello R. М., Jacyn" h А. M.
Immobilized Enzyme Chemically Modified Electrode as an Ampегоmetri e
Sensor. - Anal Chem, l98l v. 53, р. 2090-2095, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ (57) Изобретение касается исследования и анализа материалов путем определения тока и может быть исполь" зовано для определения L-аминокислот. Цель изобретения - упрощение процесса и повышение селективности определения Ь-аминокислот. Для этого в иммобилиэованную мембрану окси" дазы L-аминокислот вводят пероксидазу, электролиз проводят в слабощелочном буферном растворе в присутствии ферроцианида калия в концентрации 1-2 м1(.при ОВ на графитном электроде беэ предварительной его модификации химическим путем относительно Ag/AgC1 электрода сравнения и концентрацию L-аминокислот определяют по увеличению катодного тока.
1 ил., 5 табл.
1386883
Изобретение относится к электро" химическим методам анализа материа" лов, а именно к способу количествен" ного определения L"àìèíîêèñëîò путем измерения тока при электролизе во время ферментативных реакций, Целью изобретения является упрощение процесса и повышение селективности определения L-аминокислот, (На чертеже показана схема измерительной ячейки для осуществления способа.
Способ включает электролиз иссле" дуемого вещества в слабощелочном фосфатном буфере с использованием графитного электрода, покрытого мембраной иммобилиэованной оксидазы
4H 0 +)Fe(CN) ) +2Н перок
Количество добавляемой в мембрану пероксидазы должно быть такий, что" бы реакция, катализуемая перок" сидазой по уравнению (1), была быстрой, т.е. не лимитировала общий процесс. Для этого достаточен 1050-кратный избыток пероксидазы по сравнению с оксидазой L-аминокислот по активности. Выход за верхний предел не требуется и нецелесообразен экономически. Кроме того, при увеличении концентрации фермента увеличивается толщина мембраны, в результате увеличивается ответ электрода и уменьшается его чувствительность, Восстановление образующегося ферроцианида на графитовом электроде при О В приводит к генерации катодного тока, величина которого пропорциональна концентрации L-аминокислоты.
Предлагаемый способ не требует химической модификации графитного электрода, таким образом упрощается процесс. Повьппение селективности обеспечивается тем, что электролиэ проводится при О В, а при этом потенциале основные электрохимически активные вещества не окисляются и величины фоновых токов при введении проб реальных образцов не превьппают 17.. Поэтому концентрации L"àìèнокислот в реальных средах опре" деляют по калибровочному графику для чистого. раствора.
Измерительная ячейка состоит из корпуса I изготовленного из орга"
10
L-аминокислот, и электрода сравнения из Ag/AgC1 и измерение тока в ячейке при взаимодействии фермента с суб" стратом, перед электролизом в буферный раствор вводят ферроцианид калия в концентрации 1"2 мМ, в иммобилнзованную мембрану оксидазы L-аминокислот дополнительно вводят пероксидазу, а графитный электрод используют без химической модификации, электролиз проводят при О В и концентрацию Ь"аминокислот определяют по увеличению катодного тока.
В ферментной мембране, содержащей оксидазу Ь-аминокислот и пероксидазу, кроме окисления L-аминокис" лоты, происходит превращение по схеме сидаза 21Ре(СН),) +2Н О. (1) нического стекла и содержащего вход" ной и выходной патрубки для промыв" ки и заполнения ячейки буферным раствором, и измерительной камеры
2 с магнитной мешалкой 3, в которую помещены рабочий графитный электрод
4, покрытый иммобилизованной мем" браной 5 и электрод 6 сравнения из
30 Ag/AgC1 и которая содержит верхнее отверстие для введения пробы. Промывка и заполнение измерительной камеры буферным раствором осуществляют при помощи двухканального
35 перистальтического насос а, Рабочий и вспомогательный электроды присоединены к полярографу с самописцем.
В измерительную ячейку объемом
1 мл, содержащую буферный раствор с
40 ферроцианидом калия, вводят 0,05 мл раствора L-аминокислоты. При взаимо.действии фермента с субстратом измеряются параметры ячейки. После анализа ячейка промывается 1,5 мин стру45 ей буфера, после чего можно проводить следующее измерение.
Пример 1. Определение концентрации Ь-лейцина.
Для приготовления ферйентной мембраны 3 мг оксидазы L-аминокислот, 10 мг пероксидазы и 16 мг сывороточного альбумина растворяют в 0,2 мл
0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,5, 0,1 М КС1. Смесь обрабатыва55 ется 5 мкл 5Х- íîãî глутарового альдегида и выливается на диализную
1 мембрану площадью б см . Высушенная при 4 С мембрана, толщина которой
50 мкм, надевается. прямо на графит1386883
Из табл. 3 видно, что ток ячейки зависит от концентрации ферроцианида калия в буферном растворе.
При увеличении концентрации медиатора до 1 мМ ток увеличивается, а при концентрации соединения выше
1 мМ практически не меняется. Таким образом, способ реализуем при концентрации медиатора выше 1 мМ, а с
55 ный электрод и прикрепляется резиновым кольцом.
Определение L-лейцина при помощи приготовленного ферментного электрода проводят в 0,01 M фосфатном бу5 фере рН 7,5, содержащем 0,1 М КС1 и 2 мМ ферроцианида калия, потенциал графитного электрода 0,0 В относительно Ag/AgC1 электрода.
Данные изменения катодного тока при изменении концентрации добавленного Ь-лейцина приведены в табл. 1.
Из табл. 1 видно, что прямолинейность калибровочного графика наблюдается до 0,8 мМ ?.-лейцина.
Пример 2, Определение концентрации различных аминокислот.
Ферментная мембрана и ферментный электрод изготавливаются аналогично примеру 1. Определяется ток в буферном растворе, содержащем разные аминокислоты: 0,01 М фосфатный буфер рН 8,0, 0,1 M КС1, концентрация ферроцианида калия 1,5 мМ, концентрация аминокислот 0,5 мМ. Условия определения, как в примере 1.
Результаты представлены в табл. 2.
Из табл. 2 видно, что наилучшим субстратом для оксидазы L-аминокис30 лот является 1-лейцин, однако можно определять и L-метионин, L-Я-фенилаланин, Ь-триптофан, L èзолейцин, Ь-аргинин. D-Аминокислоты, L-алании, L"àñïàðàãèí, L-треонин и L-пролин практически не мешают определению.
Пример 3. Определение зависимости тока ячейки от концентрации ферроцианида калия и рН буферного раствора.
Каталитическая мембрана и ферментный электрод изготовлены, как в примере 1, Определяется концентрация
L-лейцина в зависимости от концентра" ции ферроцианида калия в фуберном
45 растворе рН 7, 8, концентрация L-лейцина 1,0 мМ, Условия определения, как в примере 1, Данные приведены з табл. 3. целью экономии реагента оптимальная концентрация 1 мМ.
Показания электрода зависят от рН буферного раствора. Так, при наличии в ячейке 0,6 мМ L-лейцина при рН 6 0 ток ячейки 390 нА, при рН
6,5 — 450 нА, при рН 70 — 485 нА, при рН 7,5 - 480 нА, при рН 8,0
482 нА, при рН 8,5 - 465 нА, при рН 9,0 - 436 нА, Таким образом, интервал рН 7-8 является оптимальным.
Пример 4. Определение концентрации L-лейцина в средах выращивания микроорганизмов.
Каталитическая мембрана изготовлена, как в примере 1. Среды для выращивания микроорганизмов приготовлены путем растворения соответствующих количеств Ь-лейцина в культуральных средах. Измерения проводятся, как для чистых растворов, концентрация L-лейцина определяется по калибровочному графику для чистых растворов, Условия определения, как в примере 1.
Данные измерений представлены в табл. 4, Из табл. 4 видно, что точность определения (т.е. коэффициент вариации) не превышает ЗЖ. Остаточный ток в средах не превышает 0,5-1,07, так как вещества, находящиеся в реальных растворах, являются электрохимически неактивными при нулевом потенциале графитного электрода.
Пример 5, Определение стабильности электрода во времени.
Ферментный электрод изготовлен, как в примере 1. Концентрация Ь-лейцина 0,5 мМ. Условия определения, как в примере 2.
Результаты зависимости тока от продолжительности сохранения электрода представлены в табл. 5, Из табл. 5 видно, что работоспособность электрода сохраняется в течение 2 мес.
По сравнению.с известным предлагаемый способ определения L-аминокислот является более простым, экспрессивным и селективным, так как отсутствуют операции предварительной обработки образцов, химической модификации электрода и определения влияния других веществ, которые на" ходятся в биологических реальных средах. Быстрота анализа особенно важна в микробиологической промыш1386883 ленности при непрерывном контроле уровня L -аминокислот.
Таблица 1
Концентрация 0,12 0,24 0,36 0,48 0,60 0 80 1,0 1,5
Ь-лейцина, мМ.Ою 107 Ов220 Оэ326 Оэ432 Оэ538 Ою 700 Оь 830 0 ° 905
Ток, мкА
Таблица 2
Продолжение табл.2
31,4
L- Ги ст иди н! ! ( (L-Лейцин (16,1
L-Глутамин
30!
5,0
L-Валин
100
1,7
L-Алании
94,1
Ь-Метионин!
L-)3-Фенилаланин
L-Аспарагин
83,9 с1
Ь-Треонин
L-Триптофан
57,6
L-Пролин
54,2
Ь-Изолейцин
D-Аминокислоты
49,2
L-Аргинин
Таблица 3
l 0 1,5 2,5 5,0 10,0
О ° 21 0 36 0 55 О бб Оэ73 О ° 80 Оэ82 Оэ80 Ов81 Оэ81
Ток, мкА
Формула изобретения
Способ определения L-аминокислот, включающий электролиз исследуемого вещества в буферном растворе с использованием графитового электродапокрытого мембраной иммобилизованной оксидазы L-аминокислот, и электрода сравнения из Ag/AgC1 с послеl
Концентрация ферроцианида О,1 0,2 0,4 0,6 калия, мМ дующим определением концентрации
Ь-аминокислот по увеличению тока, отличающийся тем,что, 5 с целью упрощения процесса и повыщения селективности, перед электролизом в буферный раствор вводят ферроцианид калия в концентрации 1-2 мМ, в иммобилизованную мембрану оксидазы
L"àìèíoêèñëoò дополнительно вводят пероксидазу, при этом электролиз ве" дут при нулевом потенциале относительно электрода сравнения.
1386883
Таблица 4
Концентрация Ь-лейцина, мМ
Среда
Основные компоненты
Найдено
Взято
О ю 251+0 в008
0 505+0,018
0,750+0,026
0,250 0,006
0 495 0 012
0,745 0,20
0,25
Среда для выращи» КН РО (NH ) вания дРожжей $0 в М8$04 глюкоза, вода
0 50
0,75 к НР04 кс
NaNO» Fe$Oy, мальтоэа, глю" коза, дрожжевой экстракт
0,25
Среда для выращивания В. subtilis
0,50
0,75
0,25 0,249+0,006
К,НРО КЮ„
NaCl, глюкоза, мочевина
Среда для выра" щивания Pseudomonas
0 501 0 010
0 752 0 023
0 50
0,75
)ТбблвЦб S йолмчбетео албц абцСУЗИВ ЗЛбб"
ТфКЩб
30 32 33 42 47 SO 52
8!8 19 29
Тек, ей 464 480 472 410 36S
l 386883
Составитель В. Варламов
Техред Л. Олийнык Корректор М. Шароши
Редактор О. Юрковецкая
Заказ l490/42 Тираж. 847 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
313035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4