Способ выделения митохондрий из сердечной мышцы

Способ выделения митохондрий из сердечной мышцы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и биологии. Точнее - к способам получения митохондрий, используемых для исследования энергетического состояния клетки в условиях воздействий химических веществ. Цель изобретения - повышение физиологичности и упрощение способа. Для этого вьщеляют кусочек мьпвечной ткани, помещают его в охлажденную до 0-4°С среду № 1 (имидазол 20 мМ; MgCl 9,5 мМ; АТР 5,3 мМ; фосфокреатин 15 мМ; К7.ЭГТА 8,1 мМ; К СаЭГТА 1,9 мМ; глутамат 5 мМ; малат 2 мМ, рН 7,0). В этой, среде ткань расщепляют на отдельные пучки по 1-2 мг. Группу из пяти пучков , волокон инкубируют при 0-4 С в 1 мл среды № 1, добавляя 40-60 мкг/мл спонина 20 мин при интенсивном перемешивании . Затем препараты, перемешивая , инкубируют в 1 мл среды № 2 10 мин также на холоде (состав среды № 2: имизадол 20 мМ; MgCl 4 мМ; КН,Р04 3 мМ; К ЭГТА-8,1 мМ; КгСаЭГТА 1,9 мМ; глутамат 5 мМ; малат 2 мМ; димитреитол 0,5 мМ; таурин 20 мМ; 2(|5,-морфолино) этансульфонат калия 100 мМ; рН 7,0). Концентрация магния в обеих средах по 3 мМ, кальция - 0,1 мМ. Определяют поглощение кислорода , помещая подготовленные препараты в поляриграфическую ячейку со средой № 2 и магнитной мешалкой. В ячейку вводят электрод кларка и регистрируют поглощение кислорода на -оксиметре, через каждые 3-4 мин добавляя субстраты (2 мМ малата, 4 мМ глутамата), 60 мМ АДФ, 20 мМ креатина , 1 мМ АДФ, 20 мМ креатина, 1 мМ АДФ, 20 мМ.креамина, 1 мМ АДФ, 50 мМ карбоксиатрактилозида (КАТ), 20 мМ ротенона, 10 мкг/мл антимицина, 1 мМ азида натрия. Анализируют скорость поглощения кислорода, относят их к сырому весу волокон и к общему содержанию белка в препарате и выбирают оптимальный режим обработки ткани. 2 табл. (С (Л со СХ) о:) со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

„„SU„1386907 (51) 4 С 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

®СВ "., юч

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ Р,. :: д

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ МЪЛ 11 ., „-. (21) 4188009/28-14

{22) 28.01.87 ,{46) 07.04.88. Бюл. № 13 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) В.И.Векслер, А.В.Кузнецов, В.Г.Шаров и В.А.Сакс (53) 612:015(088.8) (56) 1. Biî1. Chem. 1985, vo1 . 260, р. 7757-7764. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ

ИЗ СЕРДЕЧНОЙ МЬПИЦЫ (57) Изобретение относится к медицине и биологии, точнее — к способам получения митохондрий, используемых для исследования энергетического состояния клетки в условиях воздействий химических веществ. Цель изобретения — повышение физиологичности и упрощение способа. Для этого выделяют кусочек мышечной ткани, помещают

его в охлажденную до 0-4 С среду ¹ 1 (имидазол 20 мМ; МдС1 g 9,5 мМ; АТР

5,3 мМ; фосфокреатин 15 мМ; К ЭГТА

8,1 мМ; К СаЭГТА 1,9 мМ; глутамат

5 мМ; малат 2 мМ, рН 7,0). В этой среде ткань расщепляют на отдельные пучки по 1-2 мг. Группу из пяти пучо ков, волокон инкубчруют при 0-4 С в

1 мл среды № 1, добавляя 40-60 мкг/мл спонина 20 мин при интенсивном перемешивании. Затем препараты, перемешивая, инкубируют в 1 мл среды №- 2

10 мин также на холоде (состав среды № 2: имизадол 20 мМ; МВС1 г 4 мМ;

КН

1,9 мМ; глутамат 5 мМ; малат 2 мМ; димитреитол 0,5 мМ; таурин 20 мМ;

2(р-морфолино)этансульфонат калия

100 ; рН 7,0). Концентрация магния в обеих средах по 3 мМ, кальция—

0,1 мМ. Определяют поглощение кислорода, помещая подготовленные препараты в поляриграфическую ячейку со средой № 2 и магнитной мешалкой. В ячейку вводят электрод кларка и регистрируют поглощение кислорода на .оксиметре, через каждые 3-4 мин добавляя субстраты (2 мМ малата, 4 MM глутамата), 60 мМ АДФ, 20 мМ креатина, 1 мМ АДФ, 20 MY креагина, 1 мМ

АДФ, 20 мМ креамина, 1 мМ АДФ, 50 мМ карбоксиатрактилозида (КАТ), 20 мМ ротенона, 10 мкг/мл антимицина, 1 мМ азида натрия. Анализируют скорость поглощения кислорода, относят их к сырому весу волокон и к общему содержанию белка в препарате и выбирают оптимальный режим обработки ткани. 2 табл.

1386907

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к способам полуЧения митохондрий, используемых для исследования энергетического состоя5 ния клетки в условиях воздействий химических веществ.

Цель изобретения — повышение физиологичности и упрощение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделяют кусочек мышечной ткани, о помещают его в охлажденную до 0-4 С среду 1. В этой среде ткань расщепляют пинцетами на отдельные пучки ве ом 1-2 мг. Группу из 5 пучков волокон инкубируют при 0-4 С в 1 мл среды с добавлением 40-60 мкг/мл сапонина в течение 20 мин при интенсивном перемешивании. Затем препараты инкуби- 20 руют в 1 мл среды 2 с перемешиванием в течение 1 мин, также на холоде.

Состав среды 1 — имидазол 20 мМ, И С1 9,5 мМ, АТР 5,3 мМ, фосфокреатин 15 мМ, К ЭГТА 8,1 мМ, К СаЭГТА 25

1,9 мИ, глутамат 5 мМ, малат 2 мМ, рй 7,0.

Концентрации: магния 3 мМ, кальция

О,1 MN. Состав среды 2 — имидазол

20мМ, HgC1 4 мИ, КН РО 3 мМ, К ЭГТА . 30

8, 1 мМ, К СаЭГТА 1;9 мМ, глу тамат

5 мМ, иалат 2 мМ, дитиотреитол 0,5мМ, таурин 20 мИ 2(р-морфолино)этансульфонат калия 100 мМ, рН 7,0. Концентрации: магния 3 мМ, кальция О, 1 мМ.

Определение поглощения кислорода.

Подготовленные таким образом препараты (3-7 мг) помещали в полярографическую термостатированную ячейку, снабженную магнитной мешалкой и заполненную 1-3 мл среды 2. В ячейку

40 вводили электрод Кларка и поглощение

Кислорода регистрировали на оксиметре фирмы Yellow Spring Instruments (USA) с самописцем Linear. Чувствительность прибора — 230 мг-атом/мл кислорода на полную шкалу прибора, скорость движения бумаги 1 см/мин.

После помещения в ячейку препарата скинированных волокон и введения кислородчувствительного электрода 50 последовательно через 3-4 мин к ним добавляют субстраты (2 мМ малата, 4 мМ глутамата), 60 мкМ АДФ, 20 мМ креатина, 1 мМ АДФ, 50 мкМ карбоксиатрактилозида (КАТ), 20 мкМ ротенона, 55

10 мкг/мл антимицина, 1 мМ азида натрия. Параллельно анализируют скорости поглощения кислорода. Эти скорости рассчитывают по формуле U = A B/C, где А — растворимость кислорода, нг-атом/мл;  — скорость движения пера самописца, см/мин; С вЂ” ширина шкалы самописца, см. Полученные скорости относят к сырому весу волокон, а также к общему содержанию белка в препарате, измеренному методом Лоури.

Данные измерений позволили выбрать оптимальный режим обработки ткани (20+5 мин, концентрация сапонина

40-60 MKI /мл) .

В табл. 1 приведена зависимость влияния времени обработки и концентрации сапонина на полноту скинирования и дыхательный контроль.

Пример 1. При добавлении в оксиграфическую ячейку 6,1 мг скинированных волокон (0 75 мг общего белка) скорость поглощения кислорода без субстратов — 0; после последовательных добавок 2 MM малата и 4 мМ глута.мата — 1,387 нг-атом О /мин мг сырого веса или 11,75 нг-атом 0 /мин мг белка; 60 мкМ АДФ вЂ” соответственно

1,988 и 16,84; 20 мМ креатина — 2,59 и 21,,9; 1 мМ ЯДФ вЂ” 6,01 и 50,92;

50 мкМ КАТ вЂ” 2,03 к 17,2; прп замене

КАТ на ротенон — 0,42 и 3,55; при замене КАТ на антимицин — 0,29 и 2,45; при замене КАТ на азид натрия — 0,32 и 2,71. Таким образом, проводится оценка функционального состояния митохондрий в составе скинированных волокон сердечной ткани.„ в том числе работа системы окислительного фосфорилирования, цепи переноса электро нов, креатинкиназной системы, транспорта метаболитов, а также интактность митохондриальной мембраны.

Всего исследовано 10 проб, дыхательные характеристики скинированных волокон из сердца крысы представлены в табл, 2 (стандартная ошибка способа

7-87). Отсутствие дыхания без митохондриальнь х субстратов малата и глутамата, а также полное подавление дыхания в присутствии ингибиторов цепи переноса электронов (таких как ротенон, антимицин, азид натрия) показывает, что поглощение кислорода обусловлено только функционированием митохондрий. Высокая скорость АДФи креатинстимулируемого дыхания (152 нг-атом/мин для АТФ-стимулируемого дыхания в пересчете на мг митохондриального белка) близка в тех же условиях к скорости дыхания наиболее

1386907 интактной фракции изолированных китохондрий (160-165 нг-атом/мин на мг), что свидетельствует о нормальной работе митохондрий в составе скиниро5 ванных волокон мышечной ткани. Данные электронной микроскопии и высокая . степень ингибирования KAT равная

70Х (табл. 2), показывают наличие интактной митохондриальной мембраны.

Таким образом, митохондрии в составе скинированных волокон по их отношению к митохондриальным субстратам, ингибиторам, а также по их морфологии являются интактными митохондриями.

Кроме того, измерение содержания в скинированных волокнах цитохрома аа>, равного 20,6: 1,8 нмоль/г сырого веса, показало, что в полученных волокнах сохраняется вся популяция митохондрий (содержание цитохрома в ,ткани 21,0+1,5 нмоль/г).

Способ выделения митохондрий из сердечной мышцы, включающий разрушение сарколеммы н ионной среде, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения физиологичности и упрощения способа за счет сокращения стадий процесса, разрушение проводят обработкой сапонином в концентрации

;40-60 мкг/мл в течение 15-25 мин.

Таблица 1

Содержание ЛДГ в ткани

Время (конц. сапонина

50 мкг/мл), мин г сырого веса т исходного

2,42

О, 140

0,032

0,-027

0,027

5

5,8

1,3

1,1

1,1

Концентрация сапонина (время 20 мин), мкг/мл

Ч„,„ /Ч

2,60

2,98

2,88

3,05

2,50

1,86

250

Уменьшение содержания лактатдегидрогеназы (ЛДГ) отражает степень снятия клеточной мембраны.

Известно, что дыхательные параметры митохондрий, выделенных иэ мышечной или сердечной ткани, существенно ухудшаются при различных видах патологии. Было оценено изменение параметров дыхания скинированных волокон сердца крысы при тотальной ишемии 15 и 30 мин при 37 С (без реперфузии) и при катехоламиновой перегрузке, вызванной введением 80 мг/кг веса иэопреналина.

Пример 2. При добавлении в оксиграфическую ячейку 4,1 мг скинированных волокон сердца, подвергнутого 30 мин ишемии, скорость поглощения кислорода после последовательных добавок 4 мМ глутамата и 2 мМ малата—

1,38 нг-атом Оz/ìèí на мг сырого веса или 13,43 нг-.атом 0 /мин на мг белка;

60 мкМ АДФ соответственно — 1,65 и

16,11; 20 мМ креатина — 1,79 и 17,46;

1 мМ АДФ вЂ” 3,14 и 30,9; 40 мкМ КАТ—

1,81 и 17,7.

Как видно из примеров 1 и 2 резульI таты измерения дыхательных характеристик скинированных волокон указывают на нарушения в функционировании митохондрий сердца .при патологии и, следовательно, на нарушение энергоснабжения сердечной клети, что дает возможность применения указанного метода в диагностических целях.

Ф о р м у л а и э î б р е т е-н и я

1386907

Таблица 2 3 р!Ч 1 -V „+ /V ам р ! иг"атам 03 ц,зм,з зо,ан,е п,вг,ь и,ю.о е,о+,з ьмл з,то,г о,зло,о4 вен эц 6snaa

93 @ @ 0

3 «ЭФО ° 14 2 ° 4ИО ° t8 3> 2йОе2 б ° 13+Ое4 2 е 1+0 ° f l

МИФ W ФйфМГО

° ФФб

Составитель В. Митюшкин, Редактор В, Данко Техред Л.Сердюкова Корректор JI. Петий

Заказ 1491/43 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4