Способ культивирования клеток костного мозга человека

Способ культивирования клеток костного мозга человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к культивированию клеток человека. Целью изобретения является получение дифференцированной костной ткани. Суспензию костно-мозговых клеток культивируют на миллипоровых фильтрах , снабженных желатиновыми губками, вначале в питательной среде а-МЕМ, содержащем 20% сыворотки крови человека, 1-глютамин, витамин С, глюкозу, антибиотики, а затем после смены на среде того же состава с добав-пением Na-p-глицерофосфата в концентрации 5 -20 мМ и гидрокортизона в концентрации (0,3-3)Х Ю мМ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PEGflVSЛИН (51)5 с 12 Т4 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

:::::ЛИЖИ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 23.09.91. Бил. 35 (21) 4110403/13 (22) 11.06.86 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почет. акад. Н. Ф. Гамалеи и Институт химической физики АН СССР (72) Е. А. Лурия, С. А. Кузнецов, Е. Н. Генкина и А. Я. Фриденштейн (53) 578.085.23 (088.8) (56) Новые методы культуры тканей. М.:

Мир, Г976, с. 256.

Кузнецов С. А. и др. Днфференцировка стромальной ткани в органных культурах костного. мозга.— - Проблемы гематологии и переливания крови, 1978, т. 23, № ll, с. 42 — 48.

„SU„„1387404 А1 (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к культивированию клеток человека. Целью изобретения является получение дифференцированной костной ткани. Суспензию костно- мозговых клеток культивируют на миллипоровых фильтрах, снабженных желатиновыми губками, вначале в питательной среде а-МЕМ, содержавшем 20% сыворотки крови человека, l-глю-. тамин, витамин С, глюкозу, антибиотики, а затем после смены на среде того же .состава с добавлением Na-P-глицерофосфата в концентрации 5---20 мМ и гидрокортизона в концентрации (0,3 — 3) X 10 мМ.

1,)>< Д !1 !

I! i< с>рс".< «Ii! i>l I!!>< « tс :! I !ill<>лс« I«l If >1< !

lI! Lf I(< !1 I:I I Il! >с I!i 1<> .<)Ьт If >

< I i. «К > I! ><)(i(» i С !«111 «В. I и(Г< И (И>, I V f< tiff<

: ис!>ф I < I!Il!If)<»I;)I«I!>It I <>(1>и>й >к)!I>f.

l)pIi <>i f> / <1) piI f (тli

«. < ВЛ(Е;Il ) 1 !! ) Л<< it > .:1 l>IPIIOlf !!<)Л<)(Г« fl IÎ!:КИ Х

Иост(й лс)же!KOH Фол! кс lli!) или plit

ГР<»",) if(> ll !fi)ч< !Ид!01 В Рд< ГиоР Х(нк< а.

i<.<П !f0. 1<> В\ 1<> Тк;!НЬ ОТ, !РЛЧ!От AT КС)CTIlhlA трабскхл и р;!

<>с) ы мс)!и, );) мм . (Iолу fe«itf»(фрагменf i>t Г!ОМ(lit!1 k> l IIO Оди<>М у На 1>ОВ(pX tfO(:Tb .;!ил >Ifx фильгров Г(>< k Р (ðäçìåð

lI<)p <1,<(5 МКМ I 1!ЛОИ(!)дl К> ()4 MM . КМЛЬТИВИР()HHlIH(f1 POH0itH1 1!Я P33if(. I<. lff)) фаз: (5

I <1:1 ??!!() ?? (!i>I Il>l II ж и (кой 11 ит<>телы!О >1 P(;! l>i. (I Р Гil I! IiO(> !10 И)Ж(IIH« ДО<. 1 И! ЯРТСЯ ЗЯ

Г « 1 С >! С>, >ТО l« t )K С(Ь! >3 ФИЛЬТР Ра(НОЛЯ ГЯk)T I! I tO:I В(P< TH(.M и f!13CTI!(ila и ФОРМЕ КО! !>ЦЯ ТОЛ! ц!! I!Oft 2 мм и i!3(!!ым диаметром 50 мм 20

»(»K K 3:,Ill B l>l(ОГО(! 2 MM И Ile>((>Т 1 2 СКВОЗ1!ЫХ <)Tft«>tt, ИМ< КЧЦИХ ФОРМУ У(ЕЧЕИИОГО

КО!1)тд. !<<Я)кды!! ми ;ли)>оровый фил»гр ItoMe 1!!ЯК)) ИЯ 11,>!()т(РОРМ) ИЯД <)TBe P(THEM т3К, 11 oill>! к У. ц> VP3Jlhft(да с <(Я

I!k>l(!!(!>ерхн>с !и фильтра. 1(латформу с

<(>и.с>! )В ми IloM(III!)к>т В 1)ери(ре()ич(скук) !3("rl> !

< >> л 3> v p 3. 11 > I I 3 !i с р Р, (<3 . 1 I (и т р а л ь и у 30 а (T h

»Я IIIKII, 01 I Щ)ож(lll>ным бОртнкОМ, :t3lfoл1<;1toi раствором Xe ttêñit. (..тарилизацик>

30 и л ". Г Г. Культуральиая cpe,j;t состоит из $0% среды а-M! М, 20% сь!Ворс>гки крови иловекя IV группы, 0,05%

I-ГГ!10(дм>)н!1, (l,(5% Витамин:! (., О, l% глк>КОЗЫ, Я Г )КЖ<> i!ll Г>!6«ОТИКОВ И(ItlfllHЛЛИНЯ и стреитомицина (fl() 100 ед, ИЯ l мл), р(-1 среды 7,4. !(осле з<ацолнения газовой фазой (В(к!дух с добавлением )% (.Ор) !Яшку Кон

Вея герметически закрывают стеклянной

Kpt>tltIK<>H lip>! помо>ци замазки, которук) готовят из Вазелина с добавлением 10% 40

IIo(Kit . (<. rt tI(рдтура культи в и ров<1 ни я <<>7 (. (.(ли для культивирования и(. пользуРтся (.Î, -инкубатор, «)!i»(H Конвея не гермети«tpyIoT. (.Metiy культуряльиой средь> иа ноВую производят нд >/4 об>ема дважды в 4

tl(if(»lfo l1pH )ГОМ, начиl!яя с 7- — 5-ГО дня ку thT>fftffp<>it;II(HH. и со(Гяв питательной сре. ! и HfI!>ля Г i;I-1)-гли!и рофс)с<1)ат и гидрокортизои В к >fl< !Иь<х концентрациях соответс) fк !1;!яиiяt;) от и подвергают гисГо.:I<)t i ис к<>й <>!>р!!()<)гк(, в результате которой; Iv !Яют <.(>< з>1 или тотальньи ирена

P

20,>1 > (i! f0 К >,! Ь I lf !< if pOBi> !IH Sl ВОкру>)кс!(л!11<(,)г и:1,! !Ии«рklt<)< ти фильтров обl>;I <> <>1i:>i !It«Pl1 M!I<)l (>< .>!<>и!!д>1 и>1!и РО<((>II(>1>с >Г>. I и. iv >!<;3>> (1)if! >p<)(> <)с ГH м ll

«(и>ис с иi )Гл <к(ии< M(жк.и !Оч«ого основlI! i! с ili <(< I lii! I : th , Ti! > >1! ><>1! В. И>с >! р< tк!) !И>ло жи! < Г!1>НЧ Н> Рс Hkill«<) и;I ill(Л >Ч!! > f0 ф<>сфДГа,, f«»«(0;I(Р ка Г !и РЯ< f.f)<)j)»MI со к-:!.,i hit il H 1 ilk H M Г>!)рЯ.!0M, lip H vK3. 53 lf

II() >1 Р(,+ и,l(к >с<. 13>» иВи РОВЯ ни Я,с(иф(1>РРР и ци роия)!!!яя костнаи Ткань не <()ормируется.

71р(<и(р 2. Костиhllf мозг извлекак)Г чна:loI и !Иым об>(Я.!с)м, после чего из него приготовляк>т суспензию дезагрегировяииых клеток. Для этого косTHo-мозговую ткань в 5 мл раствора ХР!)кса мио>окрятио цроиускяют крез шприц с иглами уменьшаю>цсго(я диаметра, ffosfy«eft«yK) взвесь фильт руют через 4-слойный капроновый фильтр и ц< нтрифугируют В течение 10 M>ftf при

800 об/MHII, клето шый осадок ресуспензируют и (.реде а-NFM и доводят концеитp3tfHI0;to 1)(10 ядерных клеток на i мл.

Все последую>цие этапы культивирования проводят, как описано в примере 1. за ис кл юч ение м того, что ия поверх ность фил ьтров помеща>от не фрагменты кос г>>ого мозга, а сусиензию костно-мозговых клеток в количестВР (1 --10! )c,10 клеток на каждый фИЛЬГР. !

) таких культурах на Г)оверхиости фильтров обрязук)тся отдельные очаги и слив. ные зонь(костно-мозговых фибробластов с иримеськ> макрофагов. (Ол(ц>>ИЯ образующего(.я клеточного слоя, как и количество отложившегося основного B(.II(eства, значительно у<тупают тем, которые развиваются ири эксплантации фрагментов костного мозга

/1 ример 3. Фрагменты костного мозга. и сусцеизии костно-мозговых клеток приготовлякзт методами, аналоги >Ными тем. которые описаны В црямерах 1 и 2. Однако

fI(.p(n эксилантацией клеточных сусиеизий на фильтры помещают желатиновые губки, применяемые в клинике в качестве кровоОстандвливдющего средства. Эти губки

Г>ред(<ярителы!о разрезают на лластинки толщиной 1 мм и площадью около 20 мм . (.:уснензии клеток помещают иа поверхность желатиновьfx губок, нанося с помощью микропипетки или стеклянного капилляра по (1 — -10) )<, 10 клеток на каж))ую губку так, что клетки проникают внутрь, пропитывая всю толщу губки. Другое отличие состоит в концентрациях вводимых в культуряльнуlo среду N3-((-глицерофосфата и гидрокортизоня, сосTBBJIHfoùHõ соответстве>гио !

Ои 10 мМ.

В таких культурах, как при эксцлаитации фрагментов, так и клеточных сусцеизий, вокруг эк<.плантата развивается обци>риая, компактная, многослойная фибробластичеcK3s зонд роста и происходит иитеисивное об>разование межклеточного основного ве>цества. je, 20-дию культивирования на Г>оверхиости фильгров формируется грубоволокиистяя костная ткань, состоящая из костных балон, иокрытыл остеобластами, с замурованными 8 основном веществе осте(н(ит:Iми. 113 иоверхносги костных балок

I:Ж74(14

Ф(11) ЧИ.1 И, (> )1;((НИ:1

Составнтель И. Тарссва

Редактор Л. Волкова Те)(ред И. Верес Корректор В. Бутнга

Вакая 3729 Тираж 3 1

Подпн(нос

ВНИИ((И Государственного комитета (:CCP по делал) нзобретенпй н откр(лтнй

I 13035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д..1/5

Производственно.полнграфнческое предпрнятне, r. У)нгоро(1, ул. ((роек п)ан. 4

3 ря(.полягяк)тся и остеокласты. Кяк клетки, так и основно(вещество кости проя()л)1к)т н()л() жит ельн у ю рея к пик) на щелочную фосфатазу; основное вещество содержит большое количество неряствори м ых солей

5 кальция, т.е. подвергается минералнзяции.

Максимального развития и наиболее полной дифференцировки костная ткань достигает на 4-ю неделю культивирования.

Пример 4. Получение, эксплянтация и культивирование фрагментов и клеточных суспензий костного мозга человека осу(цествляют способом, аналогичным описанному в примере 3, за исключением того, что увеличейы концентрации Na-P-глицерофосфата и гидрокортизона (соответственно

100 и 10 мМ). Такие концентрации оказывают токсическое действие на культуры; не развивается многослойная зона роста и не происходит отложения основного ве1цества костной ткани.

1 (пособ культнви овация 1(л(11)I к )(111()I мозга человека, нключя)ощий зя(н р 1;()ст(1() мозговой ткани, полуil(ttttt из н((кл(т()ч ной суспензии, культиви(н)ванне ((11;1 мил.1)1 поровых фи,пырях в стандартной «ре t(« добавлением (.btB0I)(ITI(II l)ы и антибиотиков, с ttp(JlPjtvt()ltl(. и мно1ок1)ят ной сменой среды, птличакт и1(гя т(м, что, с целью получения дифференцированной костной ткани, на миллипоровые фильтры устанавливают желатиноные губки, и кячсстве стандартной среды используют среду сс-МЕМ, при первой смене использук)т среду

ТОГО жЕ СОСтааа, а ПРИ ПОСЛоДУЮЦ(ИХ сменах в среду дополни)ельно вводя Na-Pглицерофосфат в концентрации 5--20 мМ и гидрокортизон в концен1 рации (0,3-- 3) >()(. l0 мМ.