Способ исследования метаболизма малонового диальдегида в эритроцитах

Способ исследования метаболизма малонового диальдегида в эритроцитах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии и медицине, предназначено для диагностики мембранных нарушений у детей при патологических состояниях, сопровождающихся задержкой малонового диальдегида (МДЛ) в организме. Цель изобретения - повышение информативности способа. Для этого 1, 1,3,3-тетраметоксипропан (1- - 5 мкмолей) гидролизуют О,1N НС1 2-3 мин при 40°С, нейтрализуют и разводят в трис-НС1 буфере, рН 7,4 до конц. 10-15 ммолей в 20 мкл. В пробе периферической крови (0,5 мл) трижды отмывают эритроциты физраствором, готовят взвесь эритроцитов и по 400 мкл вносят в параллельные пробы, добавляя по 450 мкл трис-НС1 буфера. В контроль (без эритроцитов) вносят 850 мкл буфера. В 1-ю пробу и в контроль вносят по 10 мкл свежеприготовленного МДА, во 2-ю пробу - 10 мкл ; буфера. Все три пробы инкубируют 1 мин при 37°С, добавляют по 500 мкл 30%-ной трихлоруксусной кислоты, 150 мкл 5М НС1, 600 мкл 0,67%-ной тиобарбитуровой кислоты. Пробы ставят в баню при 100°С на 40-60 мин, затем в прозрачном центрифугате определяют оптическую плотность и кол-во МДА во всех 3-х пробах на СФ-26 при -532 км. :Степень деградации МДА определяют после вьмитания кол-ва МДА во пробе из 1-й пробы и выражают в % от контрольной пробы. % деградации более точен, чем нм, т.к. не меняется при добавлении в пробы эритроцитов МДА в количестве 5-20 нм. 2 табл. СО со 00 00 00

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) А1 (5D 4 С ОI N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4076897/28-14 (22) 10.06.86 (46) 15. 04.88. Бюл. Ф 14 (71) Научно-исследовательский институт педиатрии АМН СССР и Московский институт тонкой химической технологии им. M.Â. Ломоносова (72) В.В. Банкова, С.М, Макин, Т.N. Никанорова, Л.A. Кундрюцкова и И.В. Кислова (53) 612.015(088.8) (56) Evans С ° R. et al. Biochimica

et Biophysica Acta» 1985» v ° 815»

Ф 3, рр. 426-432. (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТАБОЛИЗМА

МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА В ЭРИТРОЦИТАХ (57) Изобретение относится к биохимии и медицине, предназначено для диагностики мембранных нарушений у детей при патологических состояниях, сопровождающихся задержкой малонового диальдегида (МДА) в организме. Цель изобретения — повышение информативности способа. Для этого 1,1,3,3-тетраметоксипропан (15 мкмолей) гидролизуют О» 1И НС1

2-3 мин при 40 С, нейтрализуют и раэводят в трис-НС1 буфере, рН 7,4 до конц. 10-15 ммолей в 20 мкл. В пробе периферической крови (0,5 мл) трижды отмывают эритроциты физраствором, готовят 5%-ную взвесь эритроцитов и по

400 мкл вносят в параллельные пробы, добавляя по 450 мкл трис-НС1 буфера.

В контроль (без эритроцитов) вносят

850 мкл буфера. В 1-ю пробу и в контроль вносят по 10 мкл свежеприготовленного МДА, во 2-ю пробу — 10 мкл буфера. Все три пробы инкубируют

1 мин при 37 С, добавляют по 500 мкл

30%-ной трихлоруксусной кислоты, 150 мкл 5М НС1, 600 мкл О, 67%-ной тиобар" битуровой кислоты. Пробы ставят в баню при 100 С на 40-60 мин, затем в прозрачном центрифугате определяют оптическую плотность и кол-во MjlA во всех 3-х пробах на СФ-26 при Я -532 нм.

Степень деградации МДА определяют после вычитания кол-ва МДА во 2-й про. бе из 1-й пробы и выражают в % от контрольной пробы. % деградации более точен, чем нм, т.к. не меняется при добавлении в пробы эритроцитов

МДА в количестве 5-20 нм. 2 табл.

1388805

Изобретение относится к биохимии: и медицине и может быть использовано в диагностике мембра.нных нарушений у детей при различных патологических состояниях, сопровождающихся задержкой малонового диальдегида (1ЯА) в организме, Цель изобретения — повышение информативности способа за счет допол- 10 нительного определения степени деградации МДА.

Способ осуществляется следующим, :образом. (Берут свежеприготовленный и перег- 15

1 .:нанный 1,1,3,3-тетраметоксипропан . (1-5 мкмолей), гидролизуют О, 1 N HC1 о

: 2-3 мин при 40 С с последующей нейтра-! лизацией и разводят в трис-НС1 буфере, рН 7,4 ;ии 10 — 15 нмолей в 20 мкл. Берут периферическую кровь

{0,5 мл), трижды отмывают эритроциты физраствором, приготавливают 5%-ю взвесь эритроцитов и по 400 мкл вносят в параллельные пробы, в которые добавляют по 450 мкл трис-НС1 буфера.

В контрольную пробу (без эритроцитов) вносят 850 мкл буфера. В 1-ю пробу эритроцитов и в контрольную пробу вносят точно по 10 мкл свежепригото- 30 вленного МДА, а во 2-ю пробу — 10 мкл буфера. Все три пробы инкубируют не менее 1 мин при 37 С, после чего добавляют по 500 мкл 30 -ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Добавляют

150 мкл 5М НС1 и 600 мкл 0,67 -ной тиобарбитуровой кислоты (ТБК), Пробы ставят в баню при 100 С и после 4060 мин в прозрачном центрифугате определяют оптическую плотность, а за- 40 тем количество МДА во всех трех пробах на СФ--26 при длине волны 532 нм.

Степень деградации МДА определяют после вычитания количества МДА во второй пробе из первой пробы и выражают в % от контрольной: пробы. При этом ответ в деградации: более точен, чем в нМ, поскольку возможны некоторые неточности в приготовлении новых доз МДА. Процент деградации МДА не меняется при добавлении в пробы эритроцитов МДА в количестве 5-20 нМ.

Пример . Берут 3 капли периферической крови, эритроциты трижды отмывают физраствором, готовят 5 -ю взвесь эритроцитов в трис-НС1 буфере с добавлением КС1 (50 мкл взвеси эритроцитов 950 мкл буфера), готовят две пробы эритроцитов: 400 мкл 5 -й взвеси эритроцитоэ +450 мкл трис-НС1 буфера и во вторую пробу добавляют

10 мкл экзогенного МДА (10 нМ), который приготовлен путем гидролиза

1, 1 3,3-тетраметоксипропана О, 1 н.

НС1 3 мин при 40 С с последующей нейтрализацией О, 1 í. NaOH ° Такую же дозу МДА добавляют в третью пробу, содержащую 850 мкл трис-.НС1 буфера.

Все три пробы инкубируют 3 мин при

37 С, затем добавляют 500 мкл 30

ТХУ, 150 мкл 5 н. НС1 и 600 мкл

0,67 -й ТБК, ставят в баню при 98 С на 20 мин, центрифугируют при

3000 об./мин 15 мин и надосадочную жидкость спектрофотометрируют (в микроватах) при двух длинах волн: 532 и 600 на отечественном с.пектрофотометре СФ-26. Степень деградации МДА определяют путем вычитания экстинции второй пробы из первой и деления на экстинцию третьей пробы, умножая на

100 для получения ответа в процентах. !

В табл. 1 представлены конкретные примеры определения степени деградации МДА эритроцитами.

В табл. 2 представлены данные о степени деградации МДА в эритроцитах у здоровых детей разного возраста, взрослых и при некоторых патологичес— ких состояниях у детей.

Формула и з обретения

Способ исследования метаболизма малонового диальдегида в эритроцитах путем исследования опытной пробы, содержащей эритроциты, и контрольной, не содержащей эритроцитов пробы, добавления в пробы трихлоруксусной кислоты, соляной кислоты и тиобарбитуровой кислоты с последующим нагреванием проб, охлаждением и спектрофотомегрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности способа за счет дополнительного определения степени деградации малонового диальдегида, готовят две пробы, содержащие эритроциты, в одну из них и в пробу, не содержащую эритроцитов, добавляют малоновый диальдегид, инкубируют пробы не менее

1 мин, а степень деградации малонового диальдегида определяют как раз1388805 ность оптических плотностей в пробах с эритроцитами, содержащей и не содержащей добавленный малоновый диальдегид, деленную на оптическую плотность пробы, не содержащей эритроцитов.

Таблица 1

Проба 2

Проба 3

Проба 1

Х деградации

;> нМ/пробе Е. нИ/пробе Е. нМ/пробе МДА

41,1

3, 103

29,3

3,74

22,8

4,12

34,9

3,52

21,2

4,33

17,2

4,55

18,1

4,57

14,3

4,80

8,3

5,14

23,4

5,43

40,5

4,84

15,9

5,52

Проба 1 — проба эритроцитов с экзогенным и эндогенным

Ф»

МДА.

Проба 2 — проба эритроцитов с эндогенным МДА.

Проба 3 — проба без эритроцитов (Трис-НС1 буфер) с экзогенным МДА.

П р и м е ч а н и е: С 1 по 6 — пробы эритроцитов недоношенных детей равной степени тяжести; с 7 по 10 — пробы эритроцитов рожениц во время родов; с 11 по 12 — эритроциты после предварительной инкубации с экзогенным ИДА (15 мин 37 1".) и последующего 2-3-кратного промывания их физраствором.

Таблица 2

Новорожденные дети 3-5 дней жизни, n=12

16,35 + 1,76

32,27 + 1,48

Дети 6 лет, и = 14

Дети 14-16 лет, и = 6

Взрослые люди 35-65 лет, n = 6

46,5 + 3,83

27,6 + .1,65

0,365

0,440

0,485

0,415

0,510

0,535

0,538

О, 565

0,605

0,510

0,570

0,650

0,005

0,010

0,014

О, 017

О, 026

О, 027

О, 040

О, 043

О, 046

О, 050

0,248

О, 195

0,05 0,610 5,18

0,08 0,610 5,18

О, Г20 0,610 5,18

0,15 0,610 5,18

0,21 Ов 615 5 ° 23

0,22 0,615 5,23

0,33 0,610 5,18

0,36 0,610 5,18

0,39 О) 610 5, 18

0,42 0,610 5,18

2 11 0,540 4,59

1,66 0,540 4,59

1388805

Продолжение табл.2

Новорожденные с нарушением мозгового кровообращения, n = 8

Дети 5-6 лет с церебральныи параличом, п = 10

9,65 + 0,67

26,3+ 1 32

Составитель Н. Гуляева

Техред А. Кравчук Корректор Л, Пилипенко

Редактор Т. Парфенова

Тираж 847

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1576/47

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4