Способ определения изофермента лактатдегидрогеназы-1 в сыворотке крови

Способ определения изофермента лактатдегидрогеназы-1 в сыворотке крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к иммунологии и медицинской оио.химии. Ц(.мь изобретения - создании иысокоспецифичного и простого в техническом исноочнении способа определения изофермеита лактатдеги.чрогепазы (ЛДГ) 1 к сыворотке крови. Д.чя этого используют гетерологические антитела, полученные к соответствующему изоферменту ЛДГ свиньи. Удаляют с помощью ангител к М-субъединицам 4 изоформы ЛДГ, содержащие М-субъединицы, и измеряют активность оставшегося в тестируемой сыворотке изофермента ЛДГ-1, который не содержит в своем составе М-субъединиц. Способ включает 4 стадии: определение общей ферментативной активности ЛДГ в тестируемой пробе; обработка пробы стафилококковым иммуносорбентом с целью связывания 4 изоферментов: ЛДГ-2; ЛДГ-3; ЛДГ-4 и ЛДГ-5; удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными формами ЛДГ центрифугированием; определение остаточной ферментативной активности ЛДГ, соответствующей активности изофермента ЛДГ-1 Полнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными электрофореза в агарозе образцов сыворотки, взятых до и после обработки ее стафилококковым иммуносорбентом. о (Л со со С71

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Su 4 (1 01 1л 33 49

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ „

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ ggg.,Ql

1 (21) 4119567/28-14 (22) 23.06.86 (46) 30.04.88. Бюл. № 16 (71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР, Центральный институт усовершенствования врачей, 2-й Московский медицинский институт им. Н. И. Пирогова, Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР и Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (72) Л. Г. Рашковецкий, Н. А. Гончар, Н. В. Заславская, В. Н. Прозоровский, Б. Ф. Коровкин, А. С. Циркина, В. T. Морозова, С. К. Кривоносов, Ю. С. Татаринов, И, Ф. Чернядьева, В. Н. Титов, В. К. Клеганов и Ф. С. Носков (53) 615.373(088.8) (56) Gomes М. U. Wicks R. W. Immunological

LDH, assay.

ГIатент США № 4224406, кл. 435 — 7, 1978.

„„SU„„1392508 А1 (54) СПОСОБ OI)PI-iII=. 1Е11ИЯ 11ЗОФЕ1 МЕНТА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ-1 В

СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к им му»олог»»» мед»ц»»ской б»ох»м»», Це.(ь»зобр(т »»B -- созда»»(((! (((!ко(»ец»фн (н()! и»1)о Tог(! в Tt. х(!»ч((. Koы»(. »o, !»o(! (((! (. ((особа определения »зоферл(е»та лактатдеги (роге»азы (ЛДГ) 1 в сыворотке крови. Для этого используют етерологические антитела, полученные к соответству(о(цему изоферменту ЛДГ свиньи. Удаг(яют с помощью ан(ител к М-субъедин»цам 4 изоформы ЛДГ. содержащие М-субъединицы, и измеряют активность оставшегося в тестируемой сыворотке изофермента ЛДà — 1, который не содержит в своем составе М-субьединиц. С»особ включает 4 стадии: определение общей ферментативной активности ЛДГ в тестируемой пробе; обработка»робы стафилококковым иммуносорбентом с целью связывания 4 изоферментов: ЛДГ-2; ЛДГ-3; ЛДГ-4 и ЛДГ-5; удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными формами ЛДГ центрифугированием; определение остаточной ферментативной активности ЛДГ, соответствующей активности изофермента ЛДГ-1

Г1олнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными электрофореза в агарозе образцов сыворотки, взятых до и после обработки ее стафилококковым иммуносорбентом.

1392508

11306ретс и ис Относится K H M M>< нОло> HH u медицинской биохимии

Цельк»iзобретения являет< я «оздание высокосне<си<ри <<ского и нро«гого в техническоM исполнении сно«оба онределсния изофермен1а лак гс<тдегидро<еназы (1ДГ)- l в сыворотке крови.

Спо 06 о«уще«TB.IHOTOH следующим образом.

Предлагаемыи «нособ <>пределении и сыно. рОтке. крови <«.<онс ка изофс р мента ЛДГ-1 основан на и«поль<она><ии <«1ерологических антител, нo.<у I< нных к «<>Отнетстну<ощему изоферменту IllI(«HHi

М-субъедини пам чстырех и <оформ . 1ДГ, содержащих М-«уб>ъединицы, и и eHHH активности«осганшегося в ге«ируемой сыворотке изофермснта ЛДГ-1, который не содержит в своем со«тане М-«убъединиц.

С це,<ьк»<1><1>< Hi llliil<)l о х д;<леl0M

ЛДГ «виньи, «содержащими М-субъединицы изоформами .1ДГ антитела нредваритсльно связы вак)т < нс р сl «твори мы м HO« HTp. 11. M. В качестие твердофазной основы используют убитые к;ц тки .>(вру(с>«осси«а1< геss, содержащие в «ост<<в« своей бактериа 1bsoH стенки белок А. Исгочникс>м антитсл для получения стафилококкового иммуносорбента служит гетерологическая 1<н<ис<<воротка кролика, полученная в результате иммунизации животного изоферментом г1 l,Ã -5 свиньи, содержащим только М-«убьединицы.

Способ включает че<ыр» стадии: определение общей ферментати вной a hl и ни<>сти

ЛДГ в тестируемой пробе; с>бработка пробы стафилококковым иммуносорбентом с целью связывания четыреx изоферментон:, 1ДГ-2, ЛДГ-З, ЛДГ-4 и ЛДГ-5; удаление стафилококкового иммуносорбента 0 связанными изоформами ЛДГ цс нтрифугированием; Ollределение осгаточной ферментативной активности ЛДГ, соответствую<цей активности изофермен r;I ЛДГ-1.

Первая и четвертая стадии анализа проводятся с использованием общепринятых методик определения ферментативной активности ЛДГ.

Предлагаемый способ характеризуется высокой специфичностью, поскольку имеет место количественное отделение определяемого изофермента ЛДГ-1 от четырех остальных. Полнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными электрофореза в агарозе образцов сыворотки, взятых дo и после обработоки ее стафилококковым иммуносорбентом.

Пример 1. Определение изофер мента

ЛДГ -1 в сыворотке крови человека.

А. Определение общей фс рментатиннои активности ЛДГ в тестируемой сыворотке.

Общую активность ЛДГ в тестируемых пробах определяли с помощью известного колори метрического метода. Образующийся в результате ферментативной реакции окисления лактата в пируват НАД.Н через промежуточный переносчик электронов феназинметосульфат восстанавливал соль тетразолия в окрашенный формазан, который определяли фотометрически. Величину оптической плотности растворов измеряли на колориметре ФЭК вЂ” -56 М при длине волны

490 нм. Расчет активности ЛДГ в донорской сыворотке проводили по формуле:

О61цс< Я 11 KTH в ность

lЧГ=- - — ((К ) !

1 5 где А> оптическая плотность пробы, содержащей тестируемую сыворотку", А,, оптическая плотнос1ь слепого опыта к пробе, содержащей сыворотку;

А< оптическая плотность пробы, в которую вместо сыворотки добавлен эталонный раствор;

А,—, о<пи <с скан плотность слепого опыта (1 пробе, содержащей эталонный раствор);

О активность . 1ДГ в эталонном растворс (200 Е/л) .

Ь. Обработка пробы стафилококковым иммуносорбентом, содержащим антитела к

М-субьединицам ЛДГ.

В пробирки с набухшим в фосфатно-солевом буфере стафилококковым иммуносорбетом, взятым из расчега 70 мг сухого веса бакгериальных клеток на одну пробирку, добавляли 80 мкл тестируемой сыворотки.

Соотношение об ьем сыворотки (мкл) — сухой вес стафилококкового иммуносорбента (мг) равно 1,14:1. Пробы тщательно пере> мешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре.

Стафилококковый иммуносорбент пред«тавляет собой убитые клетки Si aphylococcL

aureus, содержащие в составе своей бакте40 риальной стенки белок А с сорбированными на этом белке моноспецифическими иммуноглобулинами <> к М-субъединицам ЛДГ.

Моноспецифические антитела получены в результате иммунизаци кроликов гомогенным препаратом ЛДГ --5 свиньи и последующей очистки антисыворотки.

В. Удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными изоферментами ЛДГ

Разделение оставшегося в растворе изофермента ЛДГ-1, не содержащего М-субъединицы, и связавшихся со стафилококковым иммуносорбентом изоформ ЛДГ, содержащих в своем составе от одной до четырех

М-субьединиц (ЛДà — 2, ЛДГ 3, ЛДà — 4, . 1Дà — 5), проводили центрифугированием проб на центрифуге ЦУМ вЂ” 1 со скоростью

55 6000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин.

Г. Определение остаточной ферментативной активности ЛДГ.

1392508

Формула изобретения

Составитель В..1итовченко

Редактор И. Рыбченко Техред И. Верес Корректор М Шаро(ии

Заказ 1805! 50 Тираж 847 11одиисно»

ВНИИ11И Государственно(о комитета СССР ио (е.(ач изобретений и открыл ии

I 13035, .Иосква, Ж--35, Ра1 и(ск(о(наб., л. 4,5

Производственно-ио IHI рафическое иредиринтие, I, > ж (>p((:I, (л 11р(к лтн,(н, 4

Полноту отделения изоформы ЛДà — 1 от четырех остальных контролировали электрофоретически.

Остаточную ферментативную активность

ЛДГ в супернатанте после центрифугирования тестируемых проб, соответствующую активности изофермента ЛДà — 1, определяли так же, как и общую ЛДГ-активность (см. пример 1A). Используя полученные результаты измерения общей и остаточной ферментативной активности, рассчитывали активность и относительное содержание изофермента ЛДГ-l. используя формулу: активность ЛДГ-1 = — — - Q (Eië ), А,-А, где А — оптическая плотность пробы, содержащей обработанную стафилококковым иммуносорбентом тестируемую сыворотку;

Аз, А4, А-., (! — имеют указанные выше значения.

Полученные значения ферментативной активности и относительного содержания

ЛДГ-1 в сыворотке крови человека согласуются с известными соответствующими величинами в норме.

Пример 2. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что соотношение объем сыворотки (мкл) — сухой вес стафилококкового иммуносорбента (мг) равно 2:1.

При увеличении доли добавляемой к стафилококковому иммуносорбенту тестируемой сыворотки (отношение объема сыворотки к сухому весу стафилококкового иммуносорбента больше 2) наблюдается неполное связывание со стафилококковым иммуносорбентом и удаление из тестируемой сыворотки прежде всего изофермента ЛДГ-2, а также других изоформ, содержащих М-субъединицы.

Пример 3. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что соотношение объем сыворотки (мкл) — сухой вес стафилококковогo иммуносорбента (мг) составляло 1:1.

Уменьшение отношения объема сыворотки (мкл) к сухому весу стафилококковоIo иммуносорбента (мг) меньше 1 приводит к понижению точности определения вследствие разбавления пробы остаточным количеством влаги, содержащейся в набухшей массе стафилококкового иммуносорбента.

В сравнении с прототипом пр(t.l,i(itмый способ опр«д«ления изофс, м«(ы,i

ЛДГ--1 в сыворотке крови yilpo»t;i«I (и ределение ЛДГ благодаря примен«нпн) лько одного типа антител для разд«л«li(iя и «)форм ЛДГ, использованию допустимо10 .1 мента (ЛДГ свиньи) в качестве аг liill,hl)i получения антите.(. Примененн«г«тt Р(.l()I ( ческой антисыворотки позволя«т избе ж;I I I трудностей этического и практич«сhol о п.l;Iна, возникающих при работе с Tf)) IIII I,tì материалом как источником антнг«Holt,;ли получения гомогологич«ской антисыворотк(:.

В отличие от ковалентной «шинки антитез с полимерной матриц«й использонанп«направленного специфического и«ковал«нтHoi о связывания антител своим константным участком с белком А клегок «тафилококка увеличивает число участков ант101».1, II, аимод>йствующих с антигеном, с «охрип«нис м эффективности отделения связанныл и пе связанных с антителами изоферменто0,1Д1

Кроме того, уменьшается число оп»раций при проведении анализа; уменьшастся боле« чем в 2 раза количество сыворотки, требуемой для тестирования.

Предлагаемый способ опр«деления изофермента ЛДà — 1 в сыворотке крови открывает возможность создания набора для днаг— ности к и инфаркта-м пока рда.

Способ определения изофермента лактатдегидрогеназы-! в сыворотке крови, включающий измерение общей активности лактатдегидрогеназы в исследуемой проб», удаление изоферментов лактатдегидрог«пазы путем добавления моноспецифических антител к М-субъединицам лактатдегидрогеназы «последующим центрифугированием и определением остаточной ферментативной активности, отличающийгя тем, что, с целью упрощения способа, удаление изоферменлгов л»ктатдегидрогеназы осуществляют моноспецнфическими антителами к М-субъ«днннцам лактатдегидрогеназы свиньи, сорбироианными на убитых кл«тках St. апг«цв, «о. «1(ж,1щих белок А, при этом доба вляк) г II h h „» дуемой пробе в соотношении 1:1