Способ получения сорбента для лигандообменной хроматографии белков

Способ получения сорбента для лигандообменной хроматографии белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к способу получения сорбента для лигандообменной хроматографии белков и может быть использовано для вьщеления белков и ферментов. Изобретение позволяет получать сорбенты с повышенной сорбционной активностью по отношению к белкам (увеличение удельной активности фермента нуклеазы при его очистке в 31 раз при выходе 32%). Эффект достигается за счет обработки эпоксидированной агарозы диалкиловым эфиром иминодиуксусной кислоты в безводном диметилсульфоксиде в присутствии метилата или этилата натрия и последующего омыления 0,1-0,3 М водным раствором соли меди. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К Д BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHYET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4088329/23-05 (22) 14.07.86 (46) 15.05.88. Бюл. У 18 (7 1) Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова и Институт химической и биологической физики АН ЭССР (72) С.А.Лопатин, В.П.Варламов, С.В.Рогожин, Х.Э.Арукаэву и М. Э. Xara (53) 661. 183. 123 (088. 8) (56) Европейский патент Р 0118808, кл. С 12 P 21/02, 1984. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ

ЛИГАНДООБМЕННОИ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ

„„SU„„1395640 A 1 (51> 4 С 08 В 37/12, В Oi J 20/30, С 08 J 5/20 (57) Изобретение относится к способу получения сорбента для лигандообменной хроматографии белков и может быть использовано для выделения белков и ферментов. Изобретение позволяет получать сорбенты с повышенной сорбционной активностью по отношению к белкам (увеличение удельной активности фермента нуклеазы при его очистке в

31 раз при выходе 327). Эффект достигается за счет обработки эпоксидированной агароэы диалкиловым эфиром иминодиуксусной кислоты в безводном диметилсульфокснде в присутствии метилата или этилата натрия и последующего омыления О, 1-0,3 М водным раст- д вором соли меди.

1395640

И зобретение относится к препаративной биохимии и биотехнологии, а точнее к способу получения хелатных сорбентов для лигандообменной (метал- 5 лохелатной) хроматографии белков, содержащих в качестве стационарного лиганда иминодиуксусную кислоту (ИДК), и может быть использовано для выде.ления белков и ферментов на различ- 10 ных этапах их очистки, включая выде1

iление непосредственно из культураль-! ной жидкости.

Цель изобретения — получение сорбента с повышенной сорбционной актив- 15 ностью по отношению к белкам.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и и е р 1. К 100 r промытой водой и отжатой на пористом фильтре 20 агарозы добавляют 100 мл 2 M NaOH и 30 мл эпихлоргидрина и ведут активацию 16 ч при 20 С при непрерывном перемешивании. Активированную агарозу ромывают на пористом фильтре водой 25 о рН 7,0, 1 л ДМСО и 300 мл безводого ДМСО. В 200 мл безводного ДМСО

1 успендируют 20 r (100 мМ) хлоргидрата диметилового эфира ИДК и добавля.— т 48 мл раствора CH30Na (получен 30 астворением 4,6 r металлического натрия в 100 мл безводного метанола).

Раствор отфильтровывают от выпавшего

iocapKa NaC1, суспендируют в нем эпоКсиактивированную агарозу и добавлят 10 мл раствора CH>ONa. Реакцию ведут 16 ч при 20 С при непрерывном еремешивании, Сорберт промывают одой, выдерживают 20 мин в 0,2 М

ISO, промывают водой до рН 7 4 и обрабатывают 0,1 М раствором

Пример 2. Активацию агарозы эпихлоргидрином проводят, как описано в примере 1. В 20 мл безводного

ДИСО суспендируют 2,3 г (10 мМ) хлоргидрата диэтилового эфира ИДК и добавляют 5 мл раствора С ONa (получен растворением 1,2 r металлического натрия в 25 мл безводного этаноJIa). Раствор отфкпьтровывают от осадка NaC1 и в нем суспендируют 10 r

Эпоксиактивированной агарозы. Добавляют 1 мл раствора C gHgONa и ведут реакцию 16 ч при 20 С при перемешивании. Сорбент промывают водой (200 мл), выдерживают 20 мин в 0 2 М серной кислоте, промывают водой до рН 7. Сложноэфирные группы омыпяют

0,3 М раствором СиС1 3 мин при 20 С.

Емкость полученного сорбента по ионам меди составляет 30-35 мкмопей на мп сорбента (сорбент II).

Пример 3. К 10 г промытой водой и отжатой на пористом фильтре агарозы добавляют 10 мп 1 М NaOH и 5 мп диглицидилового эфира диэтиленгликоля. Активацию проводят 5 ч при 20 С при непрерывном перемешивании. Агарозу промывают на пористом фильтре водой до нейтрального значения рН, 100 мл ДМСО и 30 мл безводного ДМСО. Присоединение диэтилового эфира ИДК проводят аналогично описанному в примере 2. Омыпение сложноэфирных групп проводят 0,1 М раствором ацетата меди в течение 5 мин при

20 С. Емкость полученного сорбента по ионам меди составляет 20-25 мкмоль на 1 мл геля.

Пример 4 (сравнительный).

1,25 г ИДК растворяли в 12,5 мл 2 М растворе NafOЗ. В полученном растворе суспендировали 10 мл активированной агарозы. Реакционную смесь покачивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Сорбент промывали водой, обрабатывали 20 мин 0,2 М H SO промывали водой до нейтральной реакции и обрабатывали 0,1 М раствором

CuSO 5 мин при комнатной температуре. Сорбент промывали водой. Были получены синие гранулы агарозы (сорбент III).

Из полученных сорбентов I-III изготовляли колонки объемом 10 мл, которые уравновешивали водой. Затем

4 колонки промывали 0,015 М раствором ацетата натрия при рН 7,5. Из колонки, заполненной сорбентом III, вымывали 36 мкмоль меди. Затем вымывали адсорбированную медь 0,5 М раствором соляной кислоты. Из колонки с сорбен" том I вымывали 256 мкмоль, иэ колонки с сорбентом II 368 мкмоль и из колонки с сорбентом III 151 мкмоль меди.

Содержание меди в растворе определяли по оптической плотности аммиачного раствора при 600 нм по калибровочной кривой.

На основе вытеснения связанной меди можно заключить, что при связывании диэтилового эфира ИДК количество

13956

Формула изобретения

Составитель В.Мкртычан

Редактор М.Недолуженко Техред Л.Сердюкова Корректор В,Бутяга

Заказ 2464/25

Тираж 434

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r ° Ужгород, ул. Проектная, 4 связанного лиганда составляет

25,6 мкмоль/мл, а в случае диметилового эфира ИДК 36,8 мкмоль/мл. При этом сорбент является монофункциональным. Об этом свидетельствует от5 сутствие меди в растворе при вымывании колонок 0,015 М раствором ацетата натрия. В то же время при обработке активированной агарозы щелочным раствором ИДК получен сорбент, который связывает 18,7 мкмоль/мл меди.

При этом 3,6 мкмоль (19,2Х) из этого количества является слабосвязанной.

Применение полученных сорбентов для очистки ферментов. Из сорбентов и III приготовили две колонки объемом по 3 мл и уравновесили О, 1 M Naацетатным буфером рН 6,5, содержащим

0,5 М хлористый натрий. На колонки наносили со скоростью 30 мп/ч по

30 мп культуральной жидкости эндонуклеазы Ser.marcescens (лиофильно высушенный препарат растворим в уравновешивающем буфере, рН 6,5).

Исходный раствор имел оптическую плотность при 280 нм 8,0 о.е./мл и нуклеазную активность 8800 е.а./мл.

После нанесения колонки промыли уравновешивающим буфером до отсутствия Зц поглощения в элюате при 280 нм и элюировали фермент О, 1 М Йа-ацетатным буфером рН 5,0, содержащим 0,5 M хлористый натрий. На.колонке с сорбентом I очистка нуклеазы повысила ее удельную активность в 31,5 раз, выход ее составил 32Х.

На колонке с сорбентом III удельная активность повысилась только в

10,2 раза при выходе 13Х. Колонки с 40 сорбентами регенерировали 0,2 M уксусной кислотой, содержащей 1,0 M хлорис40 4 тый натрий и уравновесили О, 1 М

Na-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0,5 М хлористый натрий, 4 мг эндонуклеазы Вас.intermedius (лиофильно высушенный порошок содержит

95Х фермента) растворили в 15 мп уравновешивающего буфера и по 7 мп раствора нанесли на каждую колонку.

Оптическая плотность полученного раствора при 280 нм 0,52 о.е./мп.

В случае сорбента I был отделен несорбировавшийся балластный белок, не обладавший нуклеазной активностью.

После нанесения колонки промыли водой до полного удаления солей и элюировали О, 1 М уксусной кислотой. С сорбента I нуклеаза была элюирована с выходом 82,5Х и удельной активностью 260000 е.а./MJI> соответствующей гомогенному ферменту. С сорбента Ш нуклеазу удалось элюировать только

О, 1 М уксусной кислотой, содержащей

0,5 М хлористый натрий.

Способ получения сорбента для лигандообменной хроматографии белков путем введения в структуру эпоксидированной агарозы фрагментов иминодиуксусной кислоты, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью получения сорбента с повышенной сорбционной активностью по отношению к белкам, эпоксидированную агарозу обрабатывают диметиловым или диэтиловым эфиром иминодиуксусной кислоты в безводном диметилсульфоксиде в присутствии метилата или этилата натрия и далее омьшяют сложноэфирные группы О, 10,3 М водным раствором соли меди.