Штамм бактерий рsеudомоnаs sp.4а-деструктор углеводородов и ксенобиотиков

Штамм бактерий рsеudомоnаs sp.4а-деструктор углеводородов и ксенобиотиков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается нового штамма бактерий, котррый может быть использован для очистки морской воды от нефтяных загрязнений. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего более высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам углеводородов и ксенобиотиков в сильно минерализованных срезах. Штамм Pseu- domonas зр.БКПМ В-3829(4а) выделен КЗ морской воды Берингова моря и обладает способностью использовать в качестве углерода и энергии нефть и нефтепродукты, в которых главный , компонент - н -алканы с высокой (С, - Cj) и средней молекулярной массой (), окислять углеводороды и азокрасители в широком диапазоне концентраций. Максимальная скорость деградации углеводородов составляет: нефти 0,4 г/л, вазелинового-масла 0,2 г/л, смазочного масла 8,3 мг/л, дизельного топлива 19,5 мг/л, нефти + + о-ксилола 33,3 мг/л, дизельного топлива + о-ксилола 20 мг/л в 1. сут. Эффект деструкции азокрасителей со-- ставляет: красителя красного 2 мг/л, оранжевого 1,04 мг/л, желтого 3,12 мг/л в 1 ч. Новый штамм способен расти в средах с содержанием NaCl 3-12% и рьппе, устойчив к солям тяжелых металлов. 12 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51)4 С 12 N 1/20, С 02 Р 3/34

//(С 12 Я 1/20, С 12 11 1:38) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHolVIV СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4123359/31-13 (2 ?) 25.07.86 .(46) 15.05.88. Бюл. В 18 (71) Одесский государственный университет им. И. И. Мечникова (72) В. П. Тульчинская, А. В. Цыбань и Н. Г. Астрова (53) 663.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

11 1.307846, кл. С 12 И 1/20, 1984. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP.—

ДЕСТРУКТОР УГЛЕВОДОРОДОВ И КСЕНОБИОТИКОВ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки морской воды от нефтяных загрязнений.

Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего более высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам углеводородов и ксенобиотиков в сильно минерализованньк срезах. Штамм Pseudomonas sp.ВКПМ B-3829(4а) выделен из морской воды Берингова моря и обладает способностью использовать в качестве углерода и энергии нефть и нефтепродукты, в которых главный компонент — Н -алканы с высокой (С 9

С 1 и средней молекулярной массой (С -С ), окисля ть углеводороды и азокрасители в широком диапазоне концентраций. Максимальная скорость деградации углеводородов составляет: нефти 0,4 г/л, вазелинового масла

0,2 г/л, смазочного масла 8,3 мг/л дизельного топлива 19,5 мг/л, нефти +

+ с-ксилола 33,3 мг/л, дизельного топлива + о-ксилола 20 мг/л в 1. сут.

Эффект деструкции азокрасителей составляет: красителя красного 2 мг/л, оранжевого 1,04 мг/л, желтого

3,12 мг/л в 1 ч. Новый штамм способен расти в средах с содержанием NaC1

3-12Х и выше, устойчив к солям тяже лых металлов. 12 табл.

1395667

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки морской воды от нефтяных загрязнений, Цель изобретения — получение нового штамма бактерий; обладающего более высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам углеводородов и ксенобиотиков в сильно минерализованных средах.

Штамм бактерий Pseudomonas sp.

ВКПМ В-3829 (4-а) выделен из морской воды Берингова моря в 1981 r. и обла- 15 ,;дает способностью использовать в качестве углерода и энергии нефть и ! нефтепродукты, в которых главный компонент — ц -алканы с высокой (C„ -C„ ) и средней молекулярной массой (от С6 до С ), окислять углеводороды при широком диапазоне их концентрации.

Полное разрушение углеводородов и ксенобиотиков происходит в морской среде при использовании дополнительных биогенных субстратов, например, дестибиотина, дрожжевого экстракта.

Штамм Pseudomonas species 4-а об,ладает следующими признаками.

Иорфолого-культуральные признаки.

Прямые палочки, размеры 1-2х0,5-i

0,6 мкм, подвижные, грамотрицательные, неспорообразующие.

На рыбо-пептонном агаре.колонии

,бесцветные с гладкими краями, круг- 35 лые, блестящие, выпуклые, консистен1 ,,ция однородная, диаметр колоний 3

l4 мм.

На рыбо-пептонном бульоне рост в виде равномерного помутнения. 4О

Растет на средах с морской водой и на обычных лабораторных субстратах.

Колонии вначале прозрачные, потом становятся слегка кремовыми. Неспорообразующие. 45

На среде Кинг: дополнительных пигментов не образует.

На среде с Твин-40, Твин-80: образует фермент липазу. 50

На синтетической среде (морская соль 1,87., аммоний хлористый 1,0 г/л, калий фосфорно-кислый двузамещенный

1,0 г/л, дестибиотин (0,001_#_-ного раствора) или дрожжевой экстракт 1 мл/л 55 вода водопроводная 1000 мл, рН среды

7,2-7,5) с добавкой нефти и нефтепродуктов: дисперсный рост с помутнением среды.

Отношение к углеводородам, Растет на средах, содержащих нефть, парафин, О-ксилол, дизельное топливо, вазелиновое масло, смазочное масло. Разлагает ксенобиотики, относящиеся к диа-. зосоединениям. Отношение к антибиотикам: не чувствителен к метициллину, оксациллину, линкомицину, новобиоцину, ристомицину, слабо чувствителен к стрептомицину, мономицину. ЧуВствителен к канамицину, карбенициллину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, левомицину, олеандомицину, полимиксину. Отношение к источникам азота: бактерии штамма Pseudomonas

species 4-а-гетеротрофы и могут использовать следующие амминные соединения: .Фор мамид

Ацет амид

Пропионамид

Флюороацетамид

Глюколамтид

Акриламид

Лактамид

НСОЯН, CH CONH

СН,СН,СО11Н, CH FCONH

СН OHCONH

СНр =CHCONH

СН, CHOHCONH

В качестве факторов роста могут использовать: P -алании, метионин, L-лизин, пролин, L-аргинин, L-гистидин, аспарагин, изолейцин, лейцин и валин.

Устойчивость к солям тяжелых металлов проиллюстрирована в табл. 1.

Состав среды для получения биомассы бактерий штамма Pseudomonas speс1ез 4-а: рыбо-пептонный агар З

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный аэроб. Способен расти при температуре от -10 до 42,5 С.

Оптимум роста 20-27 С. Рост на среде с ЛаС1 5, 7, 10Х-ной и выше.

Отношение к рН; оптимум роста в области рН 6,5-8,0, с максимумом при рН 7,5. Выше рН 8,0 и ниже рН 6 5 рост удовлетворительный.

Оксидазы и каталазы образует, лецитиназы не образует, молоко пептонизирует, желатин разжижает. Рост на среде

NaC1 0,5, 3, 5, 7 и 10Х-ной и вьппе.

Оптимум роста при 3-5Х-ной NaC1. Индол сероводород и аммиак не образует.

Реакция Фогэс-Проскауэра — отрицательная ° Образует кислоту на среде с глюкозой без наличия газа. Хорошо растут на среде с лактозой и маннитом без образования кислоты и газа.

1395667 морская соль (коммерческая) ),8X, вода водопроводная 1000 мп, дестибиотин (0,001Х-ный раствор) или дрожжевой экстракт 1 мп/л, рН среды 7,0-7,2.

Условия хранения: на скошенном агаре рыбо-пептонном под стерильным медицинским вазелиновым маслом илн глицерином при 4 С или в лиофилизированном состоянии !

О

Штамм Pseudogonas species 4-а был .получен путем испытания на чувствительность морских микроорганизмов к различным источникам углерода.

Для получения использовалась следу- 5 ющая среда, г/л:-агар-агар 14,5 г, пелтон рыбный 14,5 г, морская соль.

18 г, дестибиотин (1X íûé раствор)

0,1 мл. Водопроводную воду добавляли до 1 л рН среды 7,0-7,2.

Расплавленную среду разливали по

15-20 мл в стерильные чашки Петри.

Поверхность застывшей среды засевали чистой культурой бактерий Pseudomonas species 4-а в количестве . 25

0,1 мл/500 млн. взвеси (устанавливают по бактериальному стандарту). Материал наносят с помощью стеклянного шпателя или бактериологической петJIB e 30

Бактериальную взвесь равномерно распределяли, чашки подсушивали, после чего на поверхность засеянной среды накладывали диски, пропитанные различными источниками углеводорода, 35 напрймер нефть, нефтепродукты, ксенобиотики. Чашки культивировали при

25-27 С в течение 12-24 ч и по отсутствию зон вблизи углеводородсодержащих источников или наличию их, опре 4О деляли способность штамма Pseudomonas

species 4-а расти в присутствии pasличных химических субстратов..

Сопоставительный анализ до деструкции углеводородов и -ксенобиотиков различными штаммами бактерий пред-. ставлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что штамм бактерий Pseudomonas яр. 4»а способен разлагать любой из класса углеводород- 50 содержащих субстратов. А из класса азокрасителей он расщепляет все ксенобиотики.

Кроме того, скорость разложения штаммов Pseudomonas яр. 4-а — тетраазокрасителя в 2 раза выше. Такая высокая активность штамма обуславливает значительный экологический эффект.

Деструктивная активность штамма, Pseudomonas sp. 4-а в минерализованной среде (морской воде) представлена в табл. 3.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas

species 4-а выращивали .на морской среде следующего состава: морская соль 1,8Х, аммоний хлористый 1,0 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный

1,0 г/л, дестибиотин 0,001Х раствора или дрожжевой экстракт 1 мл, вода:водопроводная 1000 мл, рН среды 7,2—

7, 5.

Нефть в качестве субстрата для деструкции вводили. н количестве мг/л:

450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50.и 2250. рН среды регулировали

10Х.-ным раствором NaOH.

Деструкцию проводили штаммом Pseudomonas species 4-а, предварительно культивированньич на рыбо-пептонном агаре,(РПА) в течение 24-36 ч при

22 С и дважды отмытым минеральной средой указанного состава (без углеводородов) посредством центрифугирования нри 4 тыс.об/мин в. течение

10 мин.

С целью создания оптимальных условий для деструкции углеводородов клетками бактерий штамм в первые 2 ч помещали на качалку. Последующее культивирование осуществляли в стаци онарных условиях при 22 С.

Результаты деструкции учитывали по исчезновению нефтяной пленки через 27,ч, 24 ч, 21 ч, 18 ч, 15 ч, 12 ч, 9 ч, 6 ч, 3 ч и 6 сут.

Результаты представлены в табл. 4.

Скорость микробной деструкции штаммом Ряеийотоиая sp. 4-а нефти при этом достигает 16,6 мг/л в 1 ч.

Деструкцию вазелинового масла осуществляли в морской воде, следующей концентрации, мг/л: 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 50 и

2750.

Результаты деструкции штаммом

Pseudomonas species 4-а регистрировали через 60 ч, 54 ч, 48 ч, 42 ч, 36 ч, 30 ч, 24 ч, 18 ч, 12 ч, 6 ч и

14 сут по исчезновению вазелинового масла в среде.

Результаты микробного разложения вазелинового масла представлены в табл. 5.

5 !395бб7 6

Скорость микробной деструкции ваэелинового масла 8,3 мг/л в 1 ч.

П р и и е р 2. При микробной деструкции смазочного масла готовили искусственный раствор морской воды, приведенный в примере 1. Смазочное масло в качестве субстрата вносили в следующем количестве, мг/л: 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, !О

50, 25 и 2275, Результаты деструкции учитывали по исчезновению в среде пленки через

,,54 сут, 48 сут, 42 сут, 36 сут,, 30 сут, 24 сут, 18 сут, 12 сут, !5 6 сут, 3 сут и 9 мес.

Результаты деструкции смазочного ! масла приведены в табл. 6.

Скорость микробной деструкции 20 8,2 мг/л в 1 сут.

Микробное разложение дизельного топлива осуществляли в морской воде, ;:Количество субстрата вносили в следующей концентрации, мг/л: 450, 400, 25

;350, 300, 250, 200, 150, 100, 25.

Результаты деструкции учитывали, через 23 сут, 20 сут, 18 сут, 15 сут, :;13 сут, 10 сут, 7,5 сут, 5 сут, 2,5 сут, 1,3 сут и 3 5 мес. 30

Результаты биодеградации дизельно:го топлива штаммом Fseudomonas sp.

;4-а представлены в табл. 7.

Скорость микробной деструкции ди зельного топлива 19,5 мг/л в сутки.

Пример 3. Микробную деструкцию комплексов углеводородов. нефть и о -ксилол и дизельное топливо о -ксилол осуществляли приведенным способом., 40

Количество нефти о -ксилола, а также дизельного топлива о — ксилола вносили в морскую воду для биодеградации в следующем количестве, мг/л: 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700.

Результаты деструкции нефти и о-ксилола учитывали через 1,5 сут, 3 сут, 6 сут, 9 сут, 12 сут, 15 сут, 18 сут и 21 сут по исчезновению в среде нефти и О -ксилола.

Данные микробного разложения нефти и о -ксилола представлены в табл. 8.

Скорость микробной деструкции нефти и о-ксилола 33,3 мг/г в сутки.

Результаты разложения дизельного топлива и о -ксилола под воздействием бактерий регистрировали через ?,5 сут

5 сут, 10 сут, 15 сут, 20 сут, 25 сут, 30 сут, 35 сут, по исчезновению в морской воде дизельного топлива и о-ксилола (табл. 9), Скорость микробной деструкции дизельного топлива и о -ксилола 20 мг/л в 1 сут.

II р и м е р 4. Микробную деструкцию штаммов Psendomonas species

4-а осуществляли в морской среде укаэанного состава в примере 1.

Ксенобиотики: краситель оранжевый (orange GH), красный (red С-бс.с), желтый (уе11о т-Г), вносили в следующем количестве, мг/л: 200, 1/5, 150, 125, !00, 75, 50, 25 и 900.

Результаты биодеструкции азокрасителя — красный учитывали через 96 ч, 84 ч, 72 ч, 60 ч, 48 ч, 36 ч, 24 ч, 12 ч по исчезновению оранжевой окраски в среде (табл. 10).

Скорость микробной деструкции азокрасителя-KpacHblH 2,0 мг /л в 1 ч.

Результаты микробного разложения азокрасителя-оранжевый учитывали через 192 ч, 168 ч, 144 ч, 120 ч, 96 ч, 72 ч, 48 ч, 24 ч по исчезновению оранжевой окрас.ки в среде (табл. 11).

Скорость микробной деструкции азокрасителя-оранжевый — 1,04 мг/л в

1 ч.

Данные биодеградации азокрасителяжелтый учитывали через 64 ч, 56 ч, 48ч, 40ч, 32ч, 24ч, 1бч, 8чпо исчезновению желтой окраски в среде (табл. 12).

Скорость микробной деструкции азокрасителя-желтый — 3,12 мг/л в час.

Таким образом, штамм Pseudomonas

species 4-а способен расти при низких (-10 С) и высоких температурах (42,5 C) максимальная скорость деградации углеводородов составляет: нефти 0,4 г/л, вазелинового масла

0,2 г/л, смазочного масла 8,3 мг/л, дизельного топлива 19,5 мг/л, нефти и о -кснлола 3),3 мг/л, дизельного топлива и о -ксилола 20 мг/л в сутки, а максимальная скорость деградации ксенобиотиков, входящих в группу азокрасителей соответственно составляет: красителя красного 2,0 мг/л, оранжевого 1,04 мг/л желтого

3,12 мг/л, в 1 ч, эффект деструкции углеводородов и ксенобиотнков при

1395667

Формула изобретения этом составляет 98-1007., устойчив к солям тяжелых металлов от 25 /мл до

1000 /мл, способен расти в средах с содержанием NaC1 (3-127 и выше) с высокой степенью деградации., Штамм бактерий Рзепбпшопая sp.

ВКПМ В-3829 деструктор углеводородов и ксенобиотиков.

Таблица 1

Концентрация, f/Më

100 500 750

50 75

Соли тяжелых металлов

Cr

Таблица 2

Количество штамма и скорость деструкции

Птаммы бактерий

Micrococcus sp

1М

Ps. spec ies

В-330

Ps. species 4-а

16,6 мг/л в. ч .

33 3 мг/л в сут

0,2 г/л в сут

8,2 мг/л в сут

Нефть . Нефть + o -ксилол

Ваэелиновое масло

Смазочное масло

19,5 мг/л в сут

Дизельное топливо

Дизельное топливо +

+ о -ксилол

20 мг/л в сут

100 мг/л-80 ч

Дизельное топливо +

+ краситель (red

С-6 с.с) 1 00 мг /л-96 ч

Субстрат для деструкции

0-ксилол + краситель (red С-6 с.с) 500 мг/л в сут 500 мг/л-150 ч

1395667

Продолжение табл.2

Субстрат для деструкции Количество штамма и скорость дест-.укции

Штаммы бактерий

Ps. species

В-330

Micrococcus sp.

1И

s. species 4-а

Деструкция ксенобиотиков

Класс Азокрасителей

2,0 мг/л в час

200 мг/л-144 ч диазокраситель:прямой/субстантивный/

/желтый — Sunchromin 3,1 2 мг/л в ч тетраазокраситель: прямой яркооранжевый — Orange 1,04 мг/л в ч

200 мг/л-30 сут

Таблица 3

Содержание NaC1 в среде, %

Суб с тра т для д еструкции

Кол-во

Смазочное масло

2, 5-3

100

0,5

2, 5-3

100

3,0

2, 5-3

7,0

96

2, 5-3

20

Таблица 4

Субстрат для деструк во В деструкции, % нНефть

450

98

400

24 моноазокраситель: кислотный красный (red. С-6 с.с) углеводорода, /100 мл среды

Скорость дес- Эффект трукции угле- деструкводорода, сут ции, %! 2

1395667

Продолжение табл.4

1ОО

350 зоо

100

100

250

100

200

100

150

tl и

lОО

100

Т аблица 5

Субстрат для дес трукции

Время, ч

Вазелиновое масло

98

500

450

98

400

350

99

300

100

250

100

200

100

150

100

100

100

100

2750 мг/л 340 ч =14 сут 100Х

100

2250 мг/л

Количество yr леводорода, концентрация мг/л

6 з

134 ч=6 сут

Эффект деструкции, Ж

13

1395667

Таблица 6

Время, ч, сут

Количество углеводорода, концентрация, мг/л

54

450

400

100

350

100

300

100

250

200

100

100

150

100

100

100

100

2275 мг/л

100

Субстрат для деструкции

Время, сут Эффект деструкции, 7

Дизельное топливо

450

98

400

99

350

100

250

100

200

100

150

7,5 100

5 100

2,5 100

1,3 100

100

25 вс

2275 мг/л

115,3сут = 100 — 3,5 мес

Субстрат для деструкции

Смазочное масло

Количество углеводорода, концентрация, мг/л

432 ч = 18 сут

288 ч = 12 сут

144 ч = 06 сут

72 ч = 3 сут

273 сут = 9 мес

Таблица 7

Эффект деструкции, Е

)395667

Таблица8

Эффект деструкции, %

Количество углево- Время, дорода, концент- сут рация, мг/л

Субстрат для деструкции

2l

350 + 350 = 700

300 + 300 = 600

250 + 250 = 500

200 + 200 = 400

150 + 150 = 300

100 + 100 = 200

50 + 50 = 100

25 + 25 = 50

Нефть + ксилол

18

15

100

100

100

100

100

1,5

Таблица 9

Субстрат для деструкции Количество углево- Время, Эффект дедорода, концентра- сут струкции, ЦИИ 1 МГ /Л %

Дизельное топливо-!б-ксилол 350 + 350 = 700

97

300 + 300 = 600

250 + 250 = 500

200 + 200 = 400

150 + 150 = 300

100 + 100 = 200

50 + 50 = 100

25 + 25 = 50

25

20

100

100

100

100

2,5

100

17

1 395667

Таблица 10

Субстрат для деструкци

200

Краситель — красный

84

150

100

100

125

100

100

100

50

100

12

100

432 ч=18 сут 100

900 мг/л

Таблица 11

Субстрат для деструкции Количество угле Время, ч Эффект водорода, кон- деструкцентрация, мг/л ции, %

200

Краситель — оранжевый

192

175

168

150

144

100

125

120

100

100

100

72

100

100

25

900 мг/л

Количество углеводорода, концентрация, мг/л

Время, ч Эффект деструкции, %

24 100

864 ч=37 сут 100

19

1395667

Таблица 12

Время,:ч

Субстрат для деструкции

64

Краситель — желтый

200

100

175

150

100

100

125

100

100

100

75

100

50

100

352 ч=15 сут 100

900 мг/л

Составитель 3. Фалунина

Редактор Я. Недолуженко Техред И.Верес Корректор Г. Решетник

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Количество углеводорода, концентрация, мг/л

Заказ 2466/26 Тираж 520 Подписное

ВШ1ИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Эффект деструкции, Ж